中药萎胃康通过影响Hedgehog通路治疗慢性萎缩性胃炎的机制研究❋

陈 露，于佳宁，吕俊慧，宋汉娜，李俊材，林海燕△

(1.滨州医学院中西医结合学院，烟台 264003； 2. 滨州医学院烟台附属医院两腺外科，山东 烟台 264100)

现代临床将以胃黏膜腺体结构减少或消失为主要病症的慢性炎症定义为慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)[1]，该病属于中医学“痞满”“胃脘痛”等范畴，临床主要表现为胃脘部的痞闷不舒、胃痛嘈杂嗳气等。据不完全统计，全世界有将近一半的人群患有不同程度的慢性胃炎，而患有CAG的患者会增加癌变的风险[2]。世界卫生组织将CAG列为癌前病变，其向癌症的转变是一种典型的不可控制的炎症反应[3-4]。在中国，胃癌则是引起癌症死亡的第三大常见原因[5]。2012年胃癌死亡人数达到723000, 占总癌症死亡率的8.8%，一跃成为世界第三大癌症死亡原因[6]。为防止癌变，慢性萎缩性胃炎的治疗尤为重要。中医药整体观和辨证论治的治疗原则可以针对CAG不同的临床症状对症下药，而萎胃康正是在此原则上研制出的，本研究针对萎胃康的治疗效果及可能机制进行探讨。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠(160±20) g，6周龄，由山东济南朋悦有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

中药萎胃康由滨州医学院附属医院制剂室提供，所有药材均符合《中国药典》(2015版)规定。本组方主要是由西洋参、白术、白芍、延胡索、三七、熊胆和甘草等药物组成。现将中药稀释成0.3 g/ml、0.15 g/ml和0.075 g/ml的水溶液，维酶素是以0.3 g/kg/d的剂量进行给药，治疗药物配好后均放在4 ℃冰箱进行保存。水杨酸钠(批号20170315)，北京索莱宝公司提供；兔抗Smo由Bioworld Technology公司提供，反应物种有人和大鼠(批号BS70534)；兔抗Shh由proteintech公司提供，针对物种有人、小鼠和大鼠(批号20697-1-AP)； 兔抗SuFu由proteintech公司提供，针对物种有人、小鼠和大鼠(批号26759-1-AP)；二抗试剂盒是抗鼠/兔通用型免疫组化试剂盒，由proteintech公司提供；5%羊血清封闭液，由Bioworld Technology公司提供。

2 方法

2.1 动物造模及分组

将120只健康雄性SD大鼠适应性喂养一周后，分为正常组(20只)和造模组(100只)。正常组大鼠每天进行生理盐水灌胃以做对照，其余大鼠用水杨酸钠按照1 ml/100 g剂量进行灌胃，前3周大鼠正常饮食饮水，后3周除正常组不做处理外其余大鼠单日足量进食，第2天禁食，饮水自由，如此反复。每周称量大鼠体质量，观察大鼠状态。造模1个月后(期间死亡3只，剩余97只)正常组抽取2只大鼠(剩余18只)，造模组抽取7只大鼠(剩余90只)，解剖后HE染色观察造模是否成功。参见《中国慢性胃炎共识意见》[7]：内镜下观察到胃黏膜变薄或缺损，中央有糜烂或出血，皱襞变平或者消失，胃腺体萎缩或消失。将造模组剩下的大鼠随机分为模型组、萎胃康高中低剂量组和维酶素组5组各18只。在每只大鼠的尾巴上进行数字标号，之后进行为期1个月的药物治疗，正常组与模型组以生理盐水灌胃，萎胃康高、中、低剂量组分别以3 g/kg/d、1.5 g/kg/d和0.75 g/kg/d的剂量灌胃，维酶素组以0.3 g/kg/d的剂量给药。

2.2 各组大鼠体质量的观察

每周进行体质量称量并记录体质量的变化，尤其是将各组大鼠治疗前后的变化与正常组大鼠进行比较。

2.3 胃黏膜组织形态学观察

分别在第10天，20天和30天的时候每组随机抽取6只大鼠禁食24 h以上后，45 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠，等大鼠进入深度麻醉后打开腹腔，迅速剪下全胃，沿胃大弯剪开，生理盐水冲洗内容物，冲洗完毕后剪成合适大小放入装有4%的多聚甲醛的EP管中进行固定，48 h后将甲醛冲洗干净后进行梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋、切片，每块切片4张，厚度为4-5 μm。一张用于H-E染色观察胃黏膜组织形态学改变，另外3张进行免疫组化检测各组蛋白的表达量变化。

2.4 指标检测

免疫组化检测各组大鼠胃黏膜的Smo、Shh和SuFu的表达量，严格按照试剂盒说明书进行操作：将石蜡切片脱蜡至水；根据抗原抗体情况，加入柠檬酸缓冲液进行抗原热修复，自然冷却后PBS清洗；加入3%H2O2，室温10 min灭活内源性酶，PBS清洗；5%羊血清室温下封闭1小时；滴加稀释好的一抗4 ℃冰箱过夜孵育后，PBS清洗；滴加抗兔/鼠HRP标记聚合物，37 ℃孵育30分钟后PBS清洗；DAB显色，镜下控制显色时间；苏木精复染后蒸馏水洗涤；各级酒精由低到高浓度脱水，二甲苯中20分钟后进行封片观察。结果用积分光密度(IOD)表示：高倍镜下随机抽取五个视野，求平均值作为每张片子的积分光密度。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 大鼠体质量变化

通过称量体质量发现，正常组大鼠体质量在实验过程中均成直线上升趋势；造模组在造模期间与正常组比较，体质量逐渐降低；后经过治疗各个治疗组大鼠体质量均成上升状态，其中以高剂量组大鼠体质量上升趋势最为明显。

3.2 病理检测结果

图1显示，造模后进行光镜下观察，可以观察到正常组胃黏膜比较厚，上皮细胞排列整齐，固有膜腺体形状规则；造模后的大鼠与正常组大鼠相比，胃黏膜变薄，固有膜上的腺体萎缩或消失，腺体形状大小不一并且排列不整齐，间质有炎症细胞浸润，伴有肠上皮化生等变化；而在经过治疗后，高剂量组中的大鼠固有膜上腺体数量增加，并且排列较模型组整齐，与正常组相似；而低剂量组相对于其余各治疗组来说效果较差，说明高剂量萎胃康对CAG有良好效果。

3.3 各组大鼠胃黏膜Smo、Shh和SuFu的表达情况

表1图2～4显示， 大鼠胃黏膜Smo蛋白、Shh蛋白和SuFu蛋白的表达在各治疗阶段的正常组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.001)，各治疗阶段高剂量组与其他治疗组比较，差异有统计学意义(P<0.001)。正常组Smo蛋白在胞膜和胞浆中呈现一种弱阳性表达；而在模型组中，Smo蛋白在胞浆和胞膜上都可见浓染的弥散状棕黄色表达；治疗后，高剂量组中Smo蛋白的阳性表达区域局限于胞浆中，表达最少；在中剂量组和西药组中，Smo蛋白的阳性表达在胞膜和胞浆中，阳性表达量较之低剂量组更少；低剂量组中Smo蛋白的阳性表达在胞浆和胞膜中。Shh蛋白正常状态下会在细胞质中有少量表达；模型组中Shh蛋白在细胞质、细胞核、胞浆和胞膜上都呈现出团块状阳性表达；高剂量组中Shh蛋白在细胞质和细胞核中有少量阳性表达；中剂量组和西药组中Shh蛋白的阳性表达区域主要是在细胞质中；低剂量组中Shh蛋白的阳性表达区域主要是在细胞质和胞浆中。SuFu蛋白在正常组中细胞质上有少量表达；在模型组中SuFu蛋白在细胞质和胞浆中呈现团块状阳性表达；高剂量组中，SuFu蛋白的阳性表达主要在细胞质中有少量表达；在中剂量组和西药组中，SuFu蛋白的阳性表达区域主要在细胞质；而在低剂量组中，SuFu蛋白在细胞质和胞浆中有阳性表达。

注：黑色箭头指示肠上皮化生，红色箭头指示腺体萎缩或消失。与正常组比较，模型组腺体萎缩或消失，大小不一，排列紊乱，肠上皮化生；经过治疗后，其中除了低剂量组的效果较差外，其余各个治疗组的胃腺体数量增加并且大小均匀，排列趋于整齐，高剂量组的效果最明显，其次中剂量组和西药组的效果也比较好图1 各组大鼠胃黏膜的H-E染色结果(×400)

组别例数(只)Smo(IOD×104)Shh(IOD×104)SuFu(IOD×104)第10天第20天第30天第10天第20天第30天第10天第20天第30天正常组188.86±0.788.59±0.938.36±0.687.75±0.617.37±0.827.19±0.509.01±0.348.68±0.778.49±0.46模型组1856.68±1.26∗∗∗54.27±2.37∗∗∗53.47±2.56∗∗∗47.32±2.24∗∗∗45.88±2.52∗∗∗43.69±1.64∗∗∗48.92±3.44∗∗∗45.51±3.02∗∗∗43.23±2.73∗∗∗萎胃康高剂量组1832.64±1.70###23.17±1.22###10.39±1.03###25.61±1.19###13.01±1.13###8.33±0.53###26.01±0.48###12.64±0.31###9.09±0.61###萎胃康中剂量组1836.86±1.63###∗∗∗30.06±1.30###∗∗∗20.39±1.24###∗∗∗36.65±1.09###∗∗∗26.38±0.97###∗∗∗20.23±0.29###∗∗∗37.44±0.99###∗∗∗24.48±0.59###∗∗∗20.47±0.83###∗∗∗萎胃康低剂量组1851.45±2.21###∗∗∗42.55±1.46###∗∗∗30.08±0.99###∗∗∗42.83±1.44###∗∗∗33.06±1.99###∗∗∗29.26±2.46###∗∗∗40.99±1.54###∗∗∗33.78±1.11###∗∗∗30.59±0.47###∗∗∗西药组1838.56±0.81###∗∗∗32.69±0.63###∗∗∗19.71±0.42###∗∗∗37.98±0.54###∗∗∗24.39±0.97###∗∗∗20.78±1.34###∗∗∗38.17±0.86###∗∗∗23.96±0.49###∗∗∗20.23±0.99###∗∗∗

注：与模型组比较：###P<0.001；与高剂量组比较：***P<0.001

注：箭头表示阳性表达区域的变化，Smo在正常组的表达呈现阴性或是弱阳性；与正常组比较，模型组中Smo的阳性表达明显增加；与模型组比较，各治疗组的阳性表达都在降低；与其余治疗组比较，高剂量组的阳性表达降低最显著，与正常组表达相似；中剂量组与西药组的表达相近，明显低于低剂量组与模型组图2 治疗30 d后各组大鼠胃黏膜Smo表达比较(×400)

注：箭头表示阳性表达区域的变化，Shh在正常组的表达呈现阴性或是弱阳性；与正常组比较，模型组中Shh的阳性表达明显增加；与模型组比较，各治疗组的阳性表达都在降低；与其余治疗组比较，高剂量组的阳性表达降低最显著，与正常组表达相似；中剂量组与西药组的表达相近，明显低于低剂量组与模型组图3 治疗30 d后各组大鼠胃黏膜Shh的表达比较(×400)

注：箭头表示阳性表达区域的变化，SuFu在正常组的表达呈现阴性或是弱阳性；与正常组比较，模型组中SuFu的阳性表达增加；与模型组比较，各治疗组的阳性表达都在降低；与其余治疗组比较，高剂量组的阳性表达降低最显著，与正常组表达相似；中剂量组与西药组的表达相近，明显低于低剂量组与模型组图4 治疗30 d后各组大鼠胃黏膜SuFu的表达比较(×400)

4 讨论

现代医学认为，从胃黏膜正常细胞发展到癌细胞是一个累积到质变的过程，如今被国际广泛接受的一种发展模式便是从慢性胃炎到慢性萎缩性胃炎到肠上皮化生到异型增生， 最终导致胃癌的发生[7]。中医认为诱导CAG的病因有很多，如脾胃素虚、饮食不调、饮酒过多、过食辛辣刺激之品等，以上因素单独或相互作用导致脾胃虚弱，脾胃虚而不健而导致其主升降的功能受损，又容易使其他病邪侵入人体，形成气滞血瘀之象。萎胃康由西洋参、白术、白芍、延胡索、三七、熊胆和甘草等药物组成。西洋参为君药，其补气养阴、清热生津的作用从根本上改善CAG的症状；白术作为臣药主归脾胃两经，性味甘淡而健脾，是临床补益脾胃之气最主要最常用的药物，长于补气以复脾之健运，与西洋参配伍，加大此方补气健脾之效；白芍长于养血敛阴柔肝，针对CAG胃脘部疼痛不舒的临床症状对症下药；延胡索活血行气止痛，主要针对CAG病变过程中气滞兼见血瘀之象；三七主入胃经，能够化瘀生新，最主要的是在化瘀过程中不会伤及人体正气；甘草在此方中为佐使药，其缓急止痛调和诸药的作用主要针对CAG临床表现中胃脘部刺痛不舒的症状。诸药共同针对此病的病因病机发挥敛阴益气、缓急止痛，清热祛湿之功。

近年来，由于刺猬信号通路(Hedgehog)在肿瘤疾病中所起到的作用以及人们发现其活动状态与各种肿瘤的进展具有密切关系。此通路主要是由配体Hedgehog(Hh)、膜蛋白受体(Smo和 Patched，简称Ptch)、下游转录因子神经胶质瘤关联癌基因同源物(Gli1、Gli2和 Gli3)、类驱动蛋白2(Cos2)、丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶(Su)以及抑制剂(SuFu)等分子组成[8-9]。在此通路激活过程配体Hh中的功能是与Ptch结合，从而可以解除Ptch对Smo的抑制，便会使Hedgehog信号通路处于一种抑制的状态。Smo是一种7次跨膜膜蛋白，在Hh不存在时与Ptch结合，受到Ptch的抑制；当Hh存在时，Ptch不再抑制Smo，Smo被磷酸化然后聚合并移动到细胞膜上，激活Fu和Cos使得SuFu失活；此前相关研究表明，有些Hedgehog抑制剂治疗肿瘤的主要机制就是可以与Smo结合，以此来阻碍Smo的细胞内信号转导，从而抑制肿瘤的增殖[10-11]。Shh蛋白参与了基因的转录和表达，与一系列肿瘤的发生发展有关，尤其是与消化道肿瘤更是密切相关，但是其具体机制尚不清楚。相关研究表明，Smo蛋白与SuFu蛋白在一些常见癌症中如胃癌、乳腺癌里的表达远远高于癌旁组织或正常组织，说明这些蛋白在癌症的进展中发挥着重大作用[12]。

中成药萎胃康治疗CAG是通过直接或间接影响到Hedgehog通路上的相关基因，从而改变它们的构象来抑制或是下调各蛋白的表达而起到治疗作用的。相关研究表明，配体Shh与受体结合后会引起原癌基因Smo的激活，从而使整个信号通路异常激活，而萎胃康的治疗机制总体上正是抑制了Hedgehog的异常激活，具体位点作用在Shh蛋白上，抑制了Shh的表达，从而使配体Shh与受体Ptch的结合受到抑制，这样一来便会降低原癌基因Smo的增加；作为Hedgehog信号通路上的负调控因子SuFu蛋白的作用靶点是位于信号通路下游的GLi因子，与GLi结合从而抑制GLi进入细胞核内发挥其转录活性，科学研究表明不同组织其调控途径的作用机制也会不同。在正常状态下，SuFu蛋白可以抑制肿瘤的发生，在Hedgehog信号通路异常激活的状态下，SuFu蛋白可能会发生突变，突变状态下的SuFu蛋白就会促进肿瘤的进展，而萎胃康在治疗过程中会降低突变SuFu蛋白的表达，从而抑制病程的进展。综上所述，萎胃康对Hedgehog信号通路调控主要是分别下调Smo蛋白、Shh蛋白和突变SuFu蛋白的表达，从而抑制整条通路的异常激活来发挥作用的。

本实验所采用的中药复方萎胃康是传统的中医学理论与科学的现代医学理论相结合而研制出来的组方，围绕此组方在前期已经进行了很多的实验，充分的实验结果表明，萎胃康可以很好地改善胃黏膜的受损情况，有着对胃腺体的修复功能，在治疗CAG方面取得了良好的效果。不仅如此，萎胃康在临床方面也进行了广泛的应用，此组方临床治疗效果较好，与常规的西医治疗比较无明显毒副作用，并取得了很好的社会效益和经济效益。在前期实验中，研究者们已经分别从整体、细胞、分子、基因水平上阐述了萎胃康在治疗CAG方面的可能作用机制，本实验通过观察萎胃康对Hedgehog信号通路上的相关因子的影响，又从另一个方面深入探讨了其治疗CAG的作用机制，对中医药在治疗CAG的广泛应用方面提供了强有力的科学依据，并开辟了一条防治新途径。