HPLC法同时测定复方木鸡颗粒中6种酚酸的含量

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1.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600;2.大连民族大学生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600

复方木鸡颗粒是在民间药方“木鸡汤”的基础上开发研制而成的颗粒剂，由云芝提取物、山豆根、菟丝子、核桃楸皮等药材制成，具有治疗肝炎、肝纤维化、肝癌的作用[1-3]。作为最具有代表性的满族药，复方木鸡颗粒对肝病治疗机制独特，具有较大的研究价值。

复方木鸡颗粒自上市以来，由于其能特异性地抑制甲胎蛋白(AFP)升高，为治疗肝病开辟了一条新途径，因而吸引了越来越多的的关注。动物实验证明，复方木鸡颗粒对化疗药物有明显的减毒作用，且具有较强的抗癌活性，在临床上可作为一种化疗药物的减毒手段和抗癌免疫增强剂，可明显提高癌症患者的治疗效果[4-11]。复方木鸡颗粒现行质量标准无含量测定项，有文献分别对该制剂中苦参碱和金丝桃苷的含量进行检测，但多成分含量测定方面未见有研究报道[4,6]。课题组在前期研究中已鉴定或推断了复方木鸡颗粒甲醇提取物中36种主要化学成分，且对其制剂中的多糖和生物碱成分进行了含量测定，本研究建立HPLC法 同时测定复方木鸡颗粒中没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸6种成分含量的分析方法，并对不同批次复方木鸡颗粒的质量进行分析与评价，为复方木鸡颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC2010A液相色谱仪(配有Class-VP工作站、在线脱气机、输液泵、自动进样器、柱温箱和紫外检测器，日本岛津公司)；KQ 2200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ME104 万分之一[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

1.2 试药 对照品香草酸(802B021)、咖啡酸(110B022)、对香豆酸(112B023)、丁香酸(C100-79561)、绿原酸(1211D022)购自北京索来宝科技有限公司，对照品没食子酸(110780-201508)购于中国食品药品检定所，各对照品质量分数均大于 98%。乙腈、甲醇和磷酸(色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团)。复方木鸡颗粒由丹东药业集团提供(批号170-101，170201，170202，170203，170303，170304)。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液的制备 精密称取对照品没食子酸、香草酸、绿原酸、丁香酸、咖啡酸和对香豆酸适量，精密称定，用甲醇配制成质量浓度分别为2.001、1.030、1.080、1.050、0.204、0.025 g·L-1的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取粉末(过60目筛)约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，残渣再次置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声30 min，放冷，滤过，合并两次滤液置蒸发皿中，水浴挥干，残渣加入甲醇适量使溶解，转移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件 采用WondaSil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以0.2%磷酸水溶液(A)-甲醇(B)为流动相，洗脱梯度：0～15 min，5%～20% B；15～20 min，20%～30% B；20～40 min，30%～40% B；40～45 min，40%～5% B；45～50 min，5% B。流速1.0 mL·min-1，检测波长 254 nm和 325 nm，柱温 30 ℃，进样量 10 μL。

2.4 系统适用性试验 精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液0.5 mL，甲醇稀释定容至10 mL，得没食子酸100.0 mg·L-1、香草酸52.50 mg·L-1、咖啡酸10.2 mg·L-1、丁香酸54.00 g·L-1、绿原酸51.50 mg·L-1、对香豆酸1.25 mg·L-1的混合对照品溶液。分别精密吸取该对照品溶液和“2.2”项下供试品溶液10 μL，按照“2.3”项下色谱条件测定，记录色谱图。本实验条件下所测得的6个成分与相邻色谱峰的分离度良好，与其他组分分离完全，没食子酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸和对香豆酸保留时间分别为11.3 min、25.5 min、27.0 min、27.6 min、28.8 min和34.9 min，色谱系统适用性实验符合含量测定要求，色谱图如图1所示。

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.1”项下对照品储备液各 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成一系列浓度(1)的混合对照品溶液。按照“2.3”项下色谱条件进行测定，以各对照品质量浓度(X，mg·L-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，各成分回归方程和线性范围见表1。结果表明，6个成分在测定范围内线性关系良好。 将混合对照品溶液逐步稀释， 分别以 S /N = 3 和 S /N = 10时各对照品的质量浓度作为检出限( LOD) 和定量限( LOQ)，结果见表 1。

表1 各被测成分的标准曲线方程、线性范围和相关系数 (n=6)

2.6 仪器精密度试验 精密吸取供试品溶液(批号：170101)5 μL，依“2.3”项下色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，计算没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸峰面积的RSD(n=6)分别为1.1%、0.46%、1.4%、1.5%、1.9%、0.74%、0.58%、1.1%、0.61%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性考察 取批号170101样品粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算含量。结果没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸和对香豆酸含量(n=6)分别为371.8、210.0、272.5、437.7、1.970、3.970 mg·L-1，其RSD分别为0.84%、4.8%、4.5%、4.0%、4.9%、4.2%、2.1%，表明重复性良好。

2.8 供试品溶液稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号：170101)，分别于配制后0、6、12、24 h进样测定，结果没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸峰面积的RSD(n=6)分别为1.8%、3.1%、2.7%、4.9%、4.2%、4.4%和3.1%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。

2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批次的复方木鸡颗粒样品(170101) 9份，每份1.0 g。精密称取没食子酸、香草酸、丁香酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸对照品适量，加甲醇分别制成没食子酸(0.8 g·L-1)、香草酸(0.4 g·L-1)、丁香酸(0.4 g·L-1)、绿原酸(0.4 g·L-1)、咖啡酸(0.008 g·L-1)、对香豆酸(0.005 g·L-1)的混合对照样品。取0.8、1.0、1.2 mL各3份，加入9份样品中。按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下的色谱条件进行含量测定，计算 6种成分的平均回收率及RSD，结果见表2。6种待测成分的平均回收率在95.3%～ 99.8%，RSD均小于5.0%，表明方法的准确度良好。

2.10 样品含量测定 分别取不同批号的复方木鸡颗粒按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定，以外标法计算6个酚酸类成分的含量，结果见表3。

表2 加样回收率 (n=3)

表2 加样回收率 (n=3)

表3 复方木鸡颗粒中6种成分含量测定结果 (/mg·g-1)

3 讨论

复方木鸡颗粒提取物中成分复杂，本实验首先考察不同比例的甲醇和乙醇为提取溶剂，以及超声和回流提取方法对方剂的提取效率，结果表明甲醇超声提取两次的各被测成分色谱峰峰面积最大，故采用甲醇溶液作为提取溶剂。

流动相的选择：由于复方中药材的化学成分复杂，故选择梯度洗脱系统。被测成分均为有机酸类物质，为了防止色谱峰拖尾，故在流动相中加入酸。考察甲醇-水、乙腈-水2种溶剂系统，以及流动相中加入不同比例的甲酸、乙酸、磷酸、醋酸铵的分离效果，结果显示甲醇-0.2%磷酸水溶液系统基线平稳，峰型较好，分离效果最佳。

波长的选择：采用 DAD二极管阵列检测器在200 ～ 400 nm范围内扫描各对照品溶液的紫外吸收，没食子酸、丁香酸和咖啡酸的最大吸收波长为270 nm，香草酸为260 nm，绿原酸为247 nm和325 nm，对香豆酸为313 nm。为保证各待测成分能得到较好的响应且分离效果最佳、干扰最少，最终选择254 nm为没食子酸、香草酸和丁香酸的检测波长；325 nm为绿原酸、咖啡酸和对香豆酸的检测波长。

复方木鸡颗粒各味药材化学成分复杂，主要含有多糖、生物碱、酚酸类和黄酮类等成分。其中酚酸类成分药理作用广泛，如抗炎症反应、抑制血小板聚集、抗血栓、抗氧化、诱导肿瘤细胞凋亡等。前期研究中从复方木鸡颗粒提取物中检测到生理活性较强、含量较高的绿原酸、没食子酸、丁香酸、对香豆酸和咖啡酸。为弥补现行方剂质量标准的不足，本实验筛选该6种酚酸类成分作为检测指标，供试品含量测定的结果表明，10批复方中没食子酸和绿原酸的含量质量分数均值为0.08%，香草酸和丁香酸的含量质量分数小于0.06%，咖啡酸和对香豆酸的含量质量分数均不足0.001%。复方木鸡颗粒中的酚酸类成分多来自核桃楸皮和菟丝子，咖啡酸和对香豆酸的含量不足0.001%，因此并不适用于复方木鸡颗粒质量的评价指标，而没食子酸、绿原酸、香草酸和丁香酸的含量可用于该方剂的质量控制。本研究基于双波长法对复方木鸡颗粒中6个酚酸类成分含量的同时测定，为复方木鸡颗粒质量评价提供新的参考。