微阵列比较基因组杂交技术在出生缺陷新生儿中的应用研究

林蔷，杨秀芳，郑铠军

(中山大学附属中山市人民医院新生儿科，广东 中山 528400)

据统计显示，我国出生缺陷发生率约为5.6%，每年新增出生缺陷患儿将近90万例[1]，而在出生缺陷患儿中有近30%在5岁前死亡，40%则终生残疾[2]。生长发育迟缓(developmental delay，DD)是较为常见的出生缺陷疾病，而导致DD发生的病因复杂，不明原因的情况占30%～60%[3]。染色体核型分析现已广泛应用染色体异常的检测中，但对于5 Mb以下的染色体异常无法准确识别。多重链接探针扩增技术可检测出5%～10%的基因拷贝数变异情况，但无法检测基因中的点突变和染色体平衡易位。微阵列比较基因组杂交技术(array-based comparative genomic hybridization，array-CGH)相比传统细胞遗传学方法，具有高通量、高分辨率、高敏感性、高准确率等优点[4]。本研究采用微阵列比较基因组杂交技术评估DD发生的遗传病因，望为其临床诊治和遗传咨询提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月至2018年10月中山大学附属中山市人民医院收治的不明原因的DD患儿20例为研究对象，所有患儿均符合DD诊断和筛选标准[5-6]。患儿年龄1～25 d，平均(9.2±6.1)d；男性12例，女性8例。排除已知明确病因者，如遗传代谢性疾病、颅内肿瘤、缺血缺氧性脑病等。所有患儿采用自身对照法，先经常规G显带染色体核型分析，设为对照组；再采用微阵列比较基因组杂交技术进一步分析(array-CGH组)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 采集患儿外周血2 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝剂，采用Blood Genome DNA Extraction Kit (takara 公司)提取基因组DNA，总量50 μL以上，浓度100～150 ng/μL，-20 ℃保存待检。

1.2.2 基因检测 采用Affymetrix公司配套检测试剂盒及优化的标准操作流程，使用CytoScanHD/CytoScan750K进行全基因组范围扫描。检测仪器：AffymetrixGeneChip System 3000Dx v.2芯片系统； 检测芯片：CytoScan HD，包括270万个探针(195万个拷贝数探针和75万个SNP 探针)，除加密覆盖拷贝数多变区、遗传疾病关联区、基因分布区等，还均匀分布人类基因组整个范围。分析软件：Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software；version3.0。质量控制：所有实验在质控标准通过的情况下，用Affymetrix Chromosome Analysis Suite Software进行分析，以Affymetrix提供的正常人DNA作为对照标准。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 患儿临床特征

20例患儿中，有5例(25%)存在特殊面容(包括头型窄长，耳朵突出，尖下巴，眼睑下垂，颅骨畸形，眼距宽，宽鼻梁，v型嘴，小耳等)；6例(30%)出现矮小、小阴茎、皮肤缺失、天性心脏病、趾畸形、阴道闭锁等。见表1。

表1 患儿临床特征

2.2 两种检测结果比较

20例患儿经常规G显带染色体核型分析表明，有2例存在染色体拷贝数变异，array-CGH检测发现有5例存在染色体拷贝数变异，两组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但两组病因确诊率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 两种检测结果比较

2.3 array-CGH检测结果

20例患儿中，有5例(25%)存在染色体拷贝数变异，根据现有的文献和数据库资料结合array-CGH检测报告，4例患儿明确病因，其中1号患儿在chr22q13.31q13.33区域发生3.8 Mb片段缺失，为22q13.3缺失综合征，又被称为Phelan-McDermid综合征；2号患儿在chr15q11.2q13.1区域发生约6.2 Mb片段缺失，与Prader-Willi综合征相关；3号患儿在chr11q24.2q25区域发生10.3 Mb片段缺失，为Jacobsen综合征；4号患儿在chr5q32处存在约311 Kb缺失片段，该片段缺失可致Treacher Collins综合征 ；5号患儿多条染色体发生了大片段纯合子(>3 Mb)现象，片段长度总和大约为171.0 Mb，占常染色体基因组片段总长度的6.0%，临床意义尚不明确。 其余患儿染色体拷贝数为正常多态性改变。见表3、图1、图2、图3、图4和图5。

表3 20例患儿array-CGH检测结果

2.4 染色体拷贝数变异情况

5例患儿存在染色体拷贝数变异，其中1号患儿基因组突变位点及涉及基因为arr[hg19] 22q13.31q13.33(47,270,321-51,115,526)x1/SHANK3(606230)；2号患儿为arr[hg19] 15q11.2q13.1(22,770,421-28,928,730)x1/UBE3A；3号患儿为arr[hg19] 11q24.2q25(124,630,054-134,938,470) x1；4号患儿为arr[hg19] 5q32(149,477,431-149,788,137) x1/CSF1R (164770)，PDGFRB (173410)，CAMK2A(114078)，TCOF1(606847)；5号患儿在多条染色体上发生大片段纯合子(hg19)。见表4。

表4 5例患儿基因拷贝数变异情况

3 讨论

染色体拷贝数变异在神经性发育障碍，如智力低下、生长发育迟缓、精神分裂症、孤独症等发病机制中起重要作用[7]。传统的G显带核型分析技术对染色体不平衡畸变引起的出生缺陷具有较广泛的应用，但对于5 Mb以下的染色体异常往往无法准确识别[8]。微阵列比较基因组杂交技术通过对全基因组的扫描，突破了传统细胞遗传学方法的诸多限制，可检测出染色体亚显微缺失和重复突变，具有高通量、高分辨率等优点[9-10]。研究[11]指出，在智力低下、多发性先天性畸形等患者的产后遗传诊断中，array-CGH检出率为7%～11%，可检测出8%的常规技术无法检测到染色体失衡。何玺玉等[12]通过array-CGH技术对不明原因ID/DD患儿进行检测，发现38%的患儿存在染色体拷贝数异常，为19%的患儿明确了病因。欧明林等[13]通过探讨array-CGH技术在染色体异常细胞遗传学分析中的作用时指出，array-CGH技术有利于筛查病理性染色体拷贝数异常，可明确染色体易位类型。本研究发现，20例患儿中，有5例(25%)存在染色体拷贝数变异，根据现有的文献和数据库资料结合array-CGH检测报告，4例(20%)患儿明确了病因，与传统的G显带核型分析技术检测结果存在显著差异。说明array-CGH技术在检测染色体亚显微缺失和明确病因方面具有较好的应用价值。

此外，array-CGH技术也存在相应的局限性，例如对染色体平衡倒位、易位等染色体结构异常无法准确识别，仅可对特定分辨率的染色体拷贝数的缺失和增加进行筛选，无法对更小的染色体异常及基因点突变做出准确的准断。另外，目前基因芯片价格相对较贵，还未得到更广泛的应用。但正如上文所述，array-CGH技术相比传统的G显带核型分析技术存在诸多优点，如在本研究中，传统的G显带核型分析技术无法确诊的患儿，经array-CGH检测明确了病因。如1号患儿经array-CGH检测发现在chr22q13.31q13.33区域发生3.8 Mb片段缺失，涉及SHANK3重要功能基因，为Phelan-McDermid综合征[14]。该综合征临床表现为发育迟缓、中到重度智力低下、有特殊面容等[15]。1号患儿临床特征与上述症状基本相符，可进一步判断为Phelan-McDermid综合征。2号患儿在chr15q11.2q13.1区域发生约6.2 Mb片段缺失，与Prader-Willi综合征相关，该综合征是一种复杂的遗传性疾病，婴儿期主要临床表现为发育迟缓，特殊面容等，与患儿临床特征相符，其发病率为1/30 000～1/10 000[16]。3号患儿在chr11q24.2q25区域发生10.3 Mb片段缺失，为Jacobsen 综合征[17]。常见的临床表现包括产前/产后物理性生长迟缓，显著的面容畸形等，与患儿临床特征相符。该综合征15%的病例因家族性平衡易位导致的不平衡分配或其他染色体重排引起[18]。4号患儿在chr5q32处存在约311.0 Kb缺失片段，包含CSF1R，PDGFRB，CAMK2A，TCOF1等功能基因，该片段缺失可致Treacher Collins综合征。常伴发育迟缓，颅面发育异常等，与患儿临床特征相符。TCOF1功能基因缺失可导致先心病的发生[19-21]。此外，5号患儿经检测发现多条染色体发生大片段纯合子(>3 Mb)现象，片段长度总和大约为171.0 Mb，占常染色体基因组片段总长度的6.0%，临床意义尚不明确，但可能增加了相应区域内一些隐性遗传病的发病风险。

综上，array-CGH技术在检测染色体亚显微缺失和明确病因方面具有显著的诊断价值，值得推广应用。