不孕不育女性维生素D和淋巴细胞亚群相关性分析

范俊梅，赵京卉，杨 佳，张志平，宋玉靖，郭慧敏，武学清*

（山西省妇幼保健院，1.生殖医学中心；2.防保科；3.临床检验中心，山西 太原 030013）

1 前 言

复发性流产和胚胎种植失败的原因包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫紊乱和血栓前状态等。有研究表明，免疫紊乱与复发性流产和胚胎植入失败有关[1-2]，占病因的50%～60%。淋巴细胞亚群是反应人体免疫状态的一项重要指标，可以在一定程度反应母体对胚胎的容受程度。

维生素D是人体必需的脂溶性维生素，从食物中获取极其有限，主要经皮肤在阳光紫外线照射下将7-脱氢胆固醇转变而来。来自膳食和皮肤合成的维生素D不具有生物活性，需要经过肝脏酶催化形成25羟维生素D（25[OH]D），是维生素D在血液中存在的主要形式，且比较稳定。维生素D经典作用是参与钙稳态和骨骼代谢，之外参与免疫调节和细胞增殖[2]。研究显示维生素D缺乏与复发性流产和胚胎种植失败相关[3]。本研究旨在探索维生素D和淋巴细胞亚群的相关性，为临床治疗提供依据。

2 对象与方法

2.1 资料来源

收集2018年1月～2018年12月山西省妇幼保健院生殖医学中心有胚胎种植失败史或(和)复发性流产史（≥2次），且要求病因学筛查的病例，排除内分泌、感染、肿瘤和肝肾功能异常者。

2.2 化验指标测定

2.2.1 25（OH）D的检测

维生素D是否缺乏，通过测定25（OH）D来估计。本研究参考美国内分泌协会推荐的标准：维生素D缺乏，25（OH）D ＜50 nmol/L（20 ng/ml）；维生素D不足，25（OH）D 50～75 nmol/L（20～30 ng/ml）。以50 nmol/L为界分为高、低水平组。空腹采集3 ml外周静脉血于抗凝管中，3000转/分钟，5分钟，取上清液进行测定，根据瑞士罗氏电化学发光免疫分析仪Modular Analytics E 170 及配套25（OH）D试剂盒，按照说明进行操作。

2.2.2 淋巴细胞亚群检测

空腹采集2 m l 外周静脉血于抗凝管中，采用美国Beckman Coulter公司的三色淋巴细胞亚群分析试剂盒、荧光素标记抗体、配套溶血剂，按照说明处理样本，通过FC 500型流式细胞仪测定,T细胞（CD3+CD19-）、CD4+T细胞（CD3+CD4+）、CD8+T细胞（CD3+CD8+）、NKT细胞（CD3+CD16+CD56+）、NK细胞（CD3-CD16+CD56+）、B细胞（CD3-CD19+），结果采用百分率的形式表示。

2.3 统计学分析

选取SPSS 24.0软件，采用Spearman相关性分析探索维生素D和淋巴细胞亚群的相关性；Mann-Whitney U检验分析不同维生素D水平CD3+和NKT细胞的差异，以α=0.05为检验水准。一般资料采用均数±标准差或者中位数（四分位距）表示。

3 结 果

3.1 一般资料

本研究共纳入病例521例，①年龄介于22～45岁之间，平均年龄为30.91 ± 0.17岁；②其中有胚胎种植失败史的345例，复发性流产176例；③25（OH）D平均值为39.84±0.65 nmol/L，其中400例小于50 nmol/L，缺乏率为76.78%（400/521），不足率为21.11%（110/521）,充足率为2.11%(11/521)；④CD3+T细胞中位数为72.20(9.25)%，CD8+T细胞中位数为28.30(9.00)%，NKT细胞中位数为2.60(3.35)%，NK细胞中位数为13.80(8.80)%，B细胞中位数为11.70(5.55)%；⑤CD4+T细胞平均值为38.53±6.83%；⑥CD4+/CD8+中位数为1.36(0.65)。

3.2 25（OH）D和淋巴细胞亚群相关性分析

①25（OH）D与CD3+T淋巴细胞、NKT细胞Spearman相关系数分别为0.108（P=0.014）和-0.168(P=0.000)；②25（OH）D与CD4+、CD8+T细胞、CD4+/CD8+、NK细胞、B细胞Spearman相关系数分别为0.053（P=0.227）、0.022(P=0.622)、0.025（P=0.565）、-0.019(P=0.669) 和-0.030（P=0.448）。

3.3 不同25（OH）D水平CD3+ 和NKT细胞表达差异

CD3+T淋巴细胞在不同25（OH）D水平表达无差异（Z=-1.260，P=0.208），NKT淋巴细胞在不同25（OH）D水平表达有差异（Z=-2.580，P=0.010）。

4 讨 论

维生素D缺乏在育龄期女性报道不一，缺乏率为20%-90%[4]，存在妊娠丢失的人群缺乏率为45%[5]。李阳等[6]报道非妊娠组25（OH）D缺乏率为84.3%，本研究缺乏率为76.78%。此外，体内维生素D水平与季节、性别有关，本研究与国内学者报道冬春季缺乏率76.90%接近，但高于夏秋季缺乏率56.80%[7]。与李阳等[6]研究中非妊娠组25（OH）D不足率为15.7%相比，本研究25（OH）D不足率21.11%更为突出，与范希景等[7]报道冬春季不足率19.70%接近，但本研究25（OH）D平均值相比更低，可能与研究纳入人群有关。

NK细胞不表达CD3+、CD4+和CD19+，大多成熟NK细胞表达CD2+、CD16+和 CD56+，其在复发性流产患者中的作用备受关注[8]。NKT细胞是自然杀伤T细胞，最早于1984年被Hercend T等学者命名，该类细胞具有NK细胞和T细胞的功能，主要表现在三方面：白细胞分化抗原1d (CD1d)的限制性、T细胞受体基因表达的恒定性和细胞因子的高表达性，通过分泌IL-2、IL-4、IL-10和I FN-γ等细胞因子参与体内抗移植排斥、抗感染和自身免疫疾病的调节[9]。有研究提示活化后的NKT细胞通过调节Th1/Th2平衡影响母胎免疫[10]。临床中一般以CD3+CD16+CD56+为志对NKT进行检测[11]，NKT细胞过高过低都可能导致流产的发生[9-12]，但目前尚无备孕及妊娠期参考范围。本研究提示25（OH）D与NKT细胞负相关，且在不同25（OH）D水平NK样细胞表达有差异，提示在调节NKT细胞治疗方案中，加入维生素D的监测，可以起到积极作用。

CD3为T淋巴细胞成熟分化的标志，主要有CD4和CD8两个亚群，成熟T细胞表达其一，参与体内免疫调节[13]。本研究显示25（OH）D与CD3+T淋巴细胞正相关，但在不同25（OH）D水平表达无差异。25（OH）D与CD4+、CD8+T淋巴细胞、CD4+/CD8+、NK细胞、B淋巴细胞无相关性，可能与样本量的限制有关。

总之，淋巴细胞亚群作为临床评价个体免疫状体的一项指标，对存在妊娠丢失和（或）胚胎种植失败史的女性中有重要指导作用。重视不孕不育女性体内维生素D的水平对于免疫调节有积极的作用。