三七粉联合玻璃体切除术对增殖性糖尿病视网膜病变患者的疗效观察及机理探究

韩梦雨 ，王志军，李伟，高征，秦亚丽，邓婷婷，訾迎新，邓宇，金明

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是目前工作年龄人群第一位的致盲性疾病[1]。增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR 的增殖阶段，其特点是视网膜缺血、缺氧和异常新生血管形成，导致玻璃体出血和牵引性视网膜脱离等病变。PDR 是导致非外伤性玻璃体积血首要原因，严重危害患者视力甚至致盲[2-6]。玻璃体切除术是目前临床上治疗PDR 引发玻璃体积血的主要方式，但病理性新生血管与视网膜粘连紧密，不仅术中极易出现医源性视网膜裂孔及大量出血，而且术后视力恢复差，易出现黄斑水肿、牵拉性视网膜脱离、玻璃体再次出血等并发症，对医生和患者均会带来一定挑战与压力[7]。三七粉为五加科植物三七的根及根茎，相关研究[3-4]表明其对玻璃体积血、视网膜出血等眼底血证具有较好的疗效。本研究通过观察比较2 组患者术前、术中、术后临床疗效差别，检测2 组患者玻璃体原液血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的浓度差异，研究单味三七粉联合玻璃体切除术组患者与单纯行玻璃体切除术组患者的临床疗效差别及其潜在机理所在。

1 对象与方法

1.1 研究对象

收集2016 年1 月—2017 年9 月就诊于中日友好医院眼科的PDR 患者（均为2 型DM)共29 例（29只眼）。将受试患者按初次就诊时间选择简单随机（抛硬币）法分为治疗组和空白组，治疗组14 例，男性8 例，女性6 例；年龄（54.57±11.47）岁；糖尿病病程（10.86±7.32）年；空腹血糖（6.6±1.28）mmol/L；糖化白蛋白（glycated albumin,GA）（13.51%±1.97%）；甘油三酯（2.02±1.97）mmol/L；总胆固醇（3.02±1.97）mmol/L；眼压（13.93±2.09）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；最佳矫正视力（bestcorrected visual acuity，BCVA）＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5 者1 只眼，0.1～≤0.3 者4 只眼，0.05～≤0.1者2 只眼，≤0.05 者6 只眼。空白组15 例，男性9 例，女性6 例；年龄（51.13±11.84）岁；糖尿病病程（11.40±4.61）年；空腹血糖（6.50±1.12）mmol/L；GA（13.60%±2.03%）；甘油三酯（1.53±0.52）mmol/L；总胆固醇（2.67±0.89）mmol/L；眼压（14.00±2.56）mmHg；BCVA＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5者1 只眼，0.1～≤0.3 者2 只眼，0.05～≤0.1 者2 只眼，≤0.05 者9 只眼。2 组患者性别、年龄、空腹血糖、GA、糖尿病病程、甘油三酯、总胆固醇、眼压、BCVA等一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 诊断标准、纳入标准及排除标准

PDR 诊断标准[8]：（1）出现视网膜新生血管（neovascular elsewhere，NVE）或视乳头新生血管（neovascular of the disc，NVD），当NVD＞1／4～1／3 视乳头直径（papilla diameter，PD）或NVE＞1／2PD，或伴视网膜前出血或玻璃体出血时称“高危增生型”（high risk PDR）；（2）出现纤维膜，可伴视网膜前出血或玻璃体出血；（3）牵拉性视网膜脱离，合并纤维膜，可合并或不合并玻璃体积血，也包括虹膜和房角的新生血管。

玻璃体积血分级标准[9]：I 级 玻璃体积血，可见视乳头及视网膜血管；II 级 轻度玻璃体积血，模糊可见视乳头；III 级 中度玻璃体积血，看不见视乳头及视网膜血管，可见眼底红光反射；IV 级 重度玻璃体积血，看不见眼底，也无眼底红光反射。

纳入标准：（1）自愿参加本临床试验，签署知情同意书；（2）诊断明确（由同一位医师），玻璃体积血II 级以上，且玻璃体积血病程≤2 周；（3）空腹血糖控制在3.9～8.0 mmol/L 以内，糖化白蛋白11.0%～16.0%，高血压患者血压控制在130/80 mm Hg 以下；（4）患者均为第1 次手术，并在术前3 个月内未接受过药物玻璃体腔注射及全视网膜光凝治疗。

排除标准：（1）伴新生血管性青光眼和(或)严重白内障的PDR 患者；（2）有严重的全身性疾病、年龄较大、近期发生过心脑血管意外的患者；（3）有可能影响视力的其他眼部疾病的患者；（4）凝血功能指标异常者；（5）排除其他疾病引起的单纯的玻璃体积血及视网膜脱离等；（6）玻璃体积血病程＞2 周者。

1.3 治疗方法

治疗组给予中日友好医院中药制剂室供应的三七粉4.5 g，冲服，每日2 次（时间为8:00 和20:00），2周后行玻璃体切除术。

空白组不予任何干预，2 周后行玻璃体切除术。

手术过程：2 组患者由同一位高年资医师在局部球后麻醉下完成手术，采用Alcon consellation 玻切超乳一体机、23G 三通道睫状体平坦部玻璃体切除术，术中所有患者先行白内障超声乳化，术中切除混浊玻璃体及积血，剥除病理性新生血管膜解除牵拉，并行全视网膜激光光凝术，如遇视网膜已脱离的情况，术中根据需要选择眼内填充物(硅油、惰性气体或平衡盐溶液等)，最后植入人工晶状体，关闭三通道。

1.4 观察指标及检查方法

BCVA：采用标准对数视力表检测视力后经同一位验光师验光矫正。

眼压：采用日本Topcon 公司非接触式眼压计测定，连续测定3 次，取平均值；

玻璃体积血吸收程度：眼部B 超（天津索微）评估玻璃体积血吸收体积；光学相干断层扫描（optical coherence tomography,OCT）（日本Topcon 公司）评估视网膜黄斑中央凹厚度；荧光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography,FFA）（德国海德堡血管造影仪HRA plus II）评价视网膜微血管瘤、出血、渗出面积及新生血管变化等。

手术时间：德国Zeiss 手术录像系统记录术中手术时间。

玻璃体原液取材方法：所有患者术眼常规术前使用复方托吡卡胺滴眼液0.5 h 快速散瞳，手术室内常规消毒铺无菌孔巾，0.75%布比卡因、2%利多卡因等比例混合后球后注射5.0～6.0 mL。于术中行标准三通道经睫状体平坦部玻璃体切割术，预置灌注头，玻璃体切割头及导光照明纤维进入眼内，玻璃体切割手术开始时关闭灌注管，于切割器开口处用无菌2 mL注射器吸引切割出的非稀释的玻璃体原液0.5～0.8 mL，分成2 份移入已消毒的Eppendorf 管中（每个Eppendorf 管中约250～300 μL），液氮转运至-80℃冰箱保存在中日友好医院临床医学研究所生物样本库。

VEGF、FN 浓度：VEGF、FN 浓度的测量使用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，人VEGF、FN 酶联免疫试剂盒购自北京瑞格博生物公司，根据试剂盒操作说明书进行操作。使用前先将试剂盒室温下平衡0.5 h。空白孔不加样，只加显色剂A、B 和终止液用于调零。标准品孔中每孔加入稀释好的标准品50 μL，零孔加入样品稀释液50 μL，在各孔中加入生物素化抗原工作液50 μL。样品孔中加入稀释2 倍样品50 μL，加入生物素化抗原工作液50 μL，轻轻摇晃，用封板膜封住反应孔，37℃温箱孵育60 min；清洗5 次后每孔再加入亲和素-HRP50 μL，用封板膜封住反应孔，37 ℃孵箱孵育60 min；然后第二次洗涤（清洗5 次）后，在每孔中加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min 后在每孔中加入终止液50 μL，（此时蓝色立转黄色）酶标仪450 nm 处读数，在10 min 内测定各孔吸光度（OD）值，根据定比稀释标准品的OD 值绘制标准曲线，根据样品OD 值和标准曲线，计算VEGF 含量。FN 的检测步骤与VEGF 相同（样品孔使用原液检测）。实验操作均严格按其说明书操作程序进行测定，且每份标本均重复3 次测定。

1.5 疗效标准

玻璃体积血吸收疗效标准[10-11]：（1）显效 玻璃体积血基本吸收，由Ⅲ～Ⅳ级转化为Ⅰ级；视力提高大于2～3 行；从无光感增加到0.05；手动／眼前增加到0.1；FFA 微血管瘤数量、渗出面积、出血3 项中有2 项以上改善，且B 超检查结果显示玻璃体腔内混浊光团数明显降低；（2）有效 玻璃体积血大部分吸收，由Ⅲ～Ⅳ级转化为Ⅱ级；视力提高大于1～2 行；从无光感增加到0.02；手动／眼前增加到0.08；FFA微血管瘤数量、渗出面积、出血3 项中有1 项以上改善，且B 超检查结果显示腔内混浊光团数有所降低；（3）无效 玻璃体积血少部分或无吸收，眼底结构仍窥不清。视力无改善甚至加重；FFA 微血管瘤数量、渗出面积、出血3 项中无改善，且B 超检查结果显示腔内混浊光团数无改善。总有效率（%）=（显效+有效）/患者只眼×100%。

1.6 统计学方法

运用SPSS20.0 对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，正态分布计量资料采用独立样本t 检验或单因素方差分析，非正态数据采用非参数检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术前2 组患者BCVA 改善及玻璃体积血吸收情况

BCVA 治疗组视力提升4 只眼，空白组视力提升0 只眼，组间差异有统计学意义（Z=-2.64，P=0.010）（表1）。

表1 2 组患者术前干预2 周及术后3 个月视力改善情况（眼只数）

玻璃体积血吸收情况 治疗组玻璃体积血显效2 只眼，有效5 只眼，无效7 只眼，积血吸收改善7 只眼，总有效率50%；空白组玻璃体积血显效0 只眼，有效2 只眼，无效13 只眼，积血吸收改善2只眼，总有效率13.3%，组间差异具有统计学意义（χ2=4.55，P=0.030）。

2.2 术中手术时间

治疗组（23.13±7.84）min，空白组（28.74±4.29）min，组间差异有统计学意义（t=2.42，P=0.020）。

2.3 术后3 个月的视力及眼压

BCVA：治疗组14 例14 只眼患者中，视力提高9 只眼(64.0%)；空白组15 例15 只眼患者中，视力提高5 只眼(33.0%)，组间差异有统计学意义(Z=-2.12，P=0.030)（表1）。

眼压：治疗组眼压（16.14±4.06）mm Hg，空白组眼压（19.13±2.75）mm Hg。组间差异有统计学意义（t=2.34，P=0.030）。

2.4 2 组患者间玻璃体中VEGF 及FN 浓度

治疗组VEGF 浓度（224.91±41.10）pg/mL，空白组VEGF 浓度（807.64±98.20）pg/mL，差异有统计学意义（t=20.57，P=0.000）。治疗组FN 浓度（3.88±0.19）μg/mL，空白组FN 浓度为（4.29±0.25）μg/mL，差异有统计学意义（t=5.00，P=0.000）。

3 讨论

玻璃体积血是引起PDR 患者视力下降甚至致盲的重要原因，非正常的新生血管形成是导致这一系列眼内病理变化的重要致盲因素[12]。玻璃体切除术是其主要治疗方法。但多数PDR 患者病情比较棘手，术中难度较大，手术带来的可能并发症等也局限了玻璃体切除术在PDR 引起的玻璃体积血中的单一应用及治疗前景[7]。因此，寻找更加完善的治疗方式尤为重要。本研究在术前未注射抗VEGF 药物治疗，主要考虑，目前PDR 引发的玻璃体积血患者，术前抗VEGF 治疗尚未得到指南或者专家共识，且相关文献认[13]为PDR 引发玻璃体积血的患者术前抗VEGF 药物的应用有可能会导致PDR 进展。

三七粉为五加科植物三七的根及根茎，为“血证要药”，具有“止血又活血，止血不留瘀”特点，为中医眼科临床治疗PDR 导致的玻璃体积血的常用组分药物。前期研究表明，三七粉可以通过以下机制发挥防治PDR 的功用：缩短凝血时间，增加凝血酶浓度，使血小板数量显著增加等来发挥止血作用[14]；纠正血糖、血脂代谢及降低视网膜GFAP 的表达对DR大鼠的视网膜起到保护作用[15-16]；抑制视网膜色素上皮细胞VEGF 的释放弱化视网膜新生血管生成[17]。

VEGF 是目前研究所知作用最强、最直接的促新生血管生成的细胞因子之一，且VEGF 与多种眼内新生血管性疾病（包括PDR）的发生发展密切相关[12]。FN 是细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的重要组成部分，目前关于FN 与PDR 发生发展关系的研究甚少。病理性新生血管是PDR 期典型病理特征，除内皮细胞外，ECM 也与血管的发生有关，其在内皮细胞的迁移、黏附、管腔重构中起重要作用。相关动物实验提示FN 在DR 大鼠的视网膜毛细血管细胞外基质中过度表达，促进视网膜微血管内皮细胞增生、毛细血管瘤形成[18]。既往研究也表明FN 刺激视网膜色素上皮细胞、巨噬/单核细胞、T/B 淋巴细胞等迁移至视网膜前或玻璃体内,导致病理纤维化及异常增殖等，形成病理性视网膜前膜及牵拉性视网膜脱离等病变[19-21]。在本研究中我们观察到，治疗组患者玻璃体VEGF 及FN 含量明显低于空白组，我们推测三七粉可以通过抑制PDR 患者VEGF 的表达这一通路，从而阻止视网膜前病理性新生血管的生长，有效促进术前PDR 患者玻璃体积血吸收、促进患者术前视力提升、缩短PDR 患者手术时间、提升患者术后视力、降低患者术后高眼压发生率。其次，三七粉可以通过抑制PDR 患者玻璃体中FN 的表达从而阻断其促进ECM 成分合成的过程，进而阻断或延缓PDR 的视网膜前膜的形成。

本研究突显出单味中药三七粉的术前干预对PDR 患者临床治疗的潜在疗效。三七粉可能通过抑制PDR 患者玻璃体中VEGF 及FN 的表达来发挥相应治疗作用。基于此，可以认为单味三七粉口服可作为PDR 导致的玻璃体积血患者术前辅助治疗手段之一。但由于PDR 的形成涉及多种因子，可能存在多条影响途径，故三七粉是直接作用于这2 种因子来发挥作用还是通过影响其他细胞生长因子或炎性因子间接发挥作用，其进一步的作用机理仍不清晰，需要今后进一步的基础及临床试验来明确，从而有可能为PDR 的临床防治提供新的有效思路和方法。