急性高原低氧对于大鼠心功能及其心肌组织miR-144表达影响的研究

冯振龙 施冰 赵永岐 朱玲玲 李俊峡

microRNA(miRNA)是一类高度保守的非编码RNA，通过与靶基因mRNA中特异的互补序列结合，诱导mRNA降解或抑制其翻译为蛋白质，在转录后水平对基因表达起着负性调控作用[1]。miRNA在许多重要的生命过程(如细胞生长、组织分化、细胞增殖、胚胎发育、细胞凋亡等)中均起着关键作用[2]。对其进行深入研究，将有助于更好地理解生物体的各种生理病理机制，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的策略和理论基础。前期研究中，课题组通过miRNA高通量测序，发现高原低氧7 d大鼠心肌组织中miR-144-3p和miR-144-5p表达丰度显著上调。为探索miR-144-3p和miR-144-5p在高原低氧急性心肌损伤中的作用机制，现将高原低氧后不同时间大鼠心肌组织miR-144-3p和miR-144-5p的表达丰度及其心功能变化的初步研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型构建与实验分组

6周龄SPF级SD大鼠，体质量为(200±20)g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。所有动物实验均通过中国人民解放军陆军总医院伦理委员会审核。采用随机数表法将SD大鼠分为实验组(低压低氧暴露3、7、14、28 d)和常压常氧对照组，每组12只动物。应用实验舱(贵州风雷航空军械有限责任公司)模拟高原低压低氧条件。实验舱参数设定：模拟海拔高度7 000 m，升降速度10 m/s，舱内压力39.1 kPa，舱内氧气压力9.022 kPa。将实验组大鼠置于实验舱内，实验舱运行时间23 h/d，昼夜比12 h∶12 h。将对照组大鼠置于实验舱外，处理等同于实验组大鼠。

1.2 大鼠超声心动图检查

各组大鼠完成实验当日出舱后立刻进行超声心动图检查。2%丙戊酸钠溶液腹腔注射麻醉后，大鼠胸前褪毛，仰卧固定。将小动物超声仪的超声探头(频率17.5 MHz)置于大鼠胸骨前，显示左室短轴切面，于乳头肌水平应用M超声记录左心室运动曲线。分别测量舒张末期左室前壁厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall depth，LVAWD)、左室后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall depth，LVPWD)、左室舒张末期内径(left ventricular internal-diastolic diameter，LVIDD)和收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole，LVIDS)，评估左心室结构。测量肺静脉峰值流速(PV peak velocity)和肺静脉峰值压差( PV peak gradient)，评估左心室舒张功能。计算左心室短轴缩短率(FS%)和射血分数(EF%)，评估左心室收缩功能。

1.3 心肌组织miRNA检测

各实验组大鼠完成超声心动图检查后采用断颈处死。收集大鼠心肌组织标本，提取总RNA后进一步进行miRNA检测。采用qRT-PCR法检测心肌组织中miRNA表达情况。应用反转录试剂盒Mir-XTMmiRNAs First-Strand Synthesis Kit(日本Takara Bio)将待测RNA反转录成cDNA。采用SYBR Advantage®qPCR Premix Kit 试剂盒(日本Takara Bio)和7500定量PCR仪(英国Applied Biosystems)进行PCR反应。PCR反应条件：95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt公式计算miRNA相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。各组实验独立重复3次。以U6 RNA为内参基因，miRNA特异性引物由广州锐博公司合成。miR-144-3p的引物为5’-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3’。miR-144-5p的引物为5’- GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGU-3’。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠超声心动图检查结果

超声心动图检查结果提示，各实验组大鼠PV peak velocity和PV peak gradient均低于对照组。其中7 d组上述生理参数下降最为明显。与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。3 d组和7 d组大鼠LVEF和FS均低于对照组，14 d组和28 d组LVEF和FS高于对照组。与对照组比较，7 d组LVEF和FS下降最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。与对照组比较，各实验组LVIDS和LVIDD均低于对照组。各实验组LVPWD均大于对照组。除7 d组外，其余实验组LVAWD均大于对照组。

表1 大鼠超声心动图检查结果

2.2 大鼠心肌组织miRNA表达

心肌组织中miR-144-3p和miR-144-5p检测结果(图2)提示，高原低氧3、7 d组大鼠心肌组织中miR-144-3p和miR-144-5p表达丰度高于对照组。高原低氧7 d组miR-144-3p和miR-144-5p表达水平高于3 d组，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。高原低氧14 d组miR-144-3p和miR-144-5p表达略低于对照组，差异无统计学意义(P>0.05)。高原低氧28 d组miR-144-3p和miR-144-5p表达高于对照组，低于3 d组和7 d组，差异有统计学意义(P>0.05)。

注：与对照组比较，**P<0.05

图1 各实验组大鼠心肌组织miR-144表达

2.3 心肌组织miR-144及miR-144-5p与EF和FS的相关性分析

大鼠心肌组织中miR-144-3p及miR-144-5p与EF和FS呈负相关。见表2、图2。

图2 心肌组织miR-144及miR-144-5p与EF、FS的相关性分析

表2 高原低压低氧大鼠心肌组织miR-144与心功能相关分析

3 讨论

近年来随着经济的快速发展，越来越多的人员移居高原地区或在高原地区工作及训练。久居平原的健康人群进入高原后，由于机体处于低氧、低气压、寒冷及强紫外线辐射等特殊环境，可以出现不同程度的不适感，大大影响其正常工作和生活。高原低氧环境对于心血管的影响是近年研究的热点。心脏对于缺氧十分敏感。早期发现急进高原的心脏受累有助于对其进行积极治疗并改善预后。

超声心动图是临床评价心脏结构和功能的常用方法，其中左心室射血分数(left ventricular ejection fractions，LVEF)和短轴缩短率(FS)可用于评价左心室收缩功能。本研究中，超声心动图检测结果提示，急进高原后3 d大鼠LVEF和FS均低于对照组，提示左心室收缩功能已出现损伤。急进高原后7 d，大鼠LVEF和FS较3 d时下降更显著，提示左心室收缩功能受损进行性加重。急进高原后14 d和28 d，大鼠LVEF和FS均高于对照组，提示左心室收缩功能恢复正常。推测急进高原后大鼠左心室收缩功能下降原因，可能系高原低氧通过化学感受器反射刺激呼吸中枢，引起呼吸加强、心率加快，外周血管阻力增加，左心室舒张期血液向外周流动速度减慢，心脏舒张末期存留在动脉中的血量增多，舒张压升高，导致急性暴露于高海拔环境的大鼠左心室收缩功能减低。随着高原低氧暴露时间延长，在等长调节机制作用下，左心室发挥了代偿功能，导致高原低氧14 d和28 d组大鼠左心室收缩功能增强，LVEF和FS均高于对照组。文献报道，低氧的直接影响可表现为心脏功能特别是左室收缩功能保持不变或者轻度增高[3]。其原因可能系低氧作用于颈动脉体导致交感神经兴奋性提高，激动心肌细胞β肾上腺素能受体，通过cAMP信号通路激活细胞膜L型钙通道，增加钙离子内流，进一步通过钙触发钙释放机制促进心肌细胞胞质内钙离子浓度增加，心肌细胞内活化的横桥数目增多，促使心肌收缩能力增强[4]。

超声心动图检查中，PV peak velocity和PV peak gradient是反映左心室舒张功能的常用生理参数。本研究发现，各实验组大鼠PV peak velocity和PV peak gradient数值均低于对照组，提示持续高原低氧环境造成左心室舒张功能受损。其原因推测系大鼠血氧下降，肺血管反应性收缩，肺动脉压力升高。肺动脉压力升高进一步导致右心房压力升高，右心舒张功能降低，从而增加三尖瓣的跨瓣压差。高原低氧不仅导致心脏收缩、舒张功能发生变化，也可导致心脏结构发生变化。本研究中超声心动图检查结果提示，各实验组大鼠左心室收缩末内径和舒张末内径均小于对照组。左心室前壁和后壁厚度均大于对照组，推测大鼠心脏结构变化系低氧对心肌细胞的直接损伤所致。高原低氧导致心脏舒张不能完全达到常氧水平，出现心肌细胞增大、心室壁增厚，舒张末期内径较对照组缩小。

文献报道，miR-144是一个进化上高度保守的miRNA，在红系祖细胞内高度特异性表达，在心肌细胞中亦有较高表达，表达量仅次于血液中。miR-144分为miR-144-3p和miR-144-5p, 与机体的生理功能密切相关。Ovcharenko等[5]研究发现，导入miR-144等miRs可影响Caspase级联反应活性。预测这些内源性miRs的靶点包括编码死亡受体、Caspases和其他凋亡相关基因。将miR-144类似物转染至大鼠H9C2心肌细胞，可见心肌细胞增生明显降低，Caspase-3活性明显升高，细胞凋亡率明显升高[6]，提示miR-144是促进心肌细胞凋亡的基因。

在本研究中，我们发现高原低氧3、7 d组大鼠心肌组织miR-144表达高于对照组。高原低氧14 d组大鼠心肌组织miR-144表达略低于对照组。高原低氧28 d组大鼠心肌组织miR-144表达略高于对照组。相关性分析提示心肌组织miR-144表达水平与EF和FS呈负相关，提示miR-144可能参与调控高原低氧心肌损伤，可能是与高原低氧条件下心功能变化密切相关的基因。本实验结果为从基因水平探索高原低氧心肌损伤的作用机制提供了实验基础，为防治高原病的干预策略提供了新的思路和干预靶点。