Q61R和V112A突变的HRAS基因在NIH小鼠体内诱发肿瘤的实验研究

张 峰，赵 龙，樊金萍吴雪伶孟淑芳*

（1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.包头市肿瘤医院，内蒙古 包头 014030）

肿瘤细胞基因组DNA及其片段可在体外试验中转化NIH 3T3细胞，使其获得体内致瘤能力，肿瘤细胞基因组DNA中具有转化能力的基因被称为癌基因。HRAS属于RAS基因家族（包括HRAS、KRAS和NRAS），通过与GTP/GDP结合，RAS蛋白作为分子开关调节与细胞存活和增殖相关的RAF-MEK-ERK、PI3K/AKT等信号传导通路，HRAS突变与多种肿瘤的发生密切相关[1]。体内外试验中，虽然Q61L突变的HRAS（T24-HRAS）可在转基因动物中诱发尿路上皮癌[2]，但正常HRAS基因需要其他癌基因（如SV40的大T抗原或cMYC基因）的辅助才能转化细胞[3]。2008年，Li等使用分别表达T24-HRAS和cMYC的混合质粒首次在NIH小鼠中诱发皮肤肿瘤，剂量为每只12.5μg时，肿瘤发生率分别为20%（成年小鼠）和82%（乳鼠）。使用同时表达T24-HRAS和cMYC的单一质粒，肿瘤发生率提高至40%（成年小鼠）和100%（乳鼠）。进一步研究中，使用NK细胞和T细胞缺陷的CD3ε小鼠替代NIH小鼠，成年小鼠中的致瘤率提高至75%，最低致瘤剂量降低至每只800 pg[4-6]。但截至目前尚没有使用单一的HRAS表达质粒在小鼠体内试验中诱发肿瘤的报道。本研究尝试使用含有G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突变的HRAS（V112A）表达质粒通过皮内注射在NIH小鼠体内诱发肿瘤。

1 材料与方法

1.1 细胞株、动物和主要材料

人结肠癌DiFi细胞和L929小鼠成纤维瘤细胞由中国食品药品检定研究院细胞室提供；SPF级NIH小鼠由中国食品药品检定研究院试验动物繁育中心提供；HRAS基因由DiFi细胞中扩增，经测序，其含有V112A突变，将其命名为HRAS（V112A）；pCDNA3.1（+）质粒由本室保存；鼠抗人HRAS抗体和鼠抗GAPDH抗体购自中杉金桥公司；引物（表1）由上海生物工程技术有限公司合成；Trizol、Lipofectamine 2000和逆转录试剂盒（Superscript First-Strand Synthesis System）购自Invitrogen公司；pMD-18-T载体、2×Primer Start Premix购自Takara公司；质粒大提试剂盒购自Gibco公司。

表1 研究中使用的引物

1.2 HRAS（V112A）的克隆

Trizol提取DiFi细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作，随机引物逆转录合成cDNA。以合成的cDNA为模板，以HRAS-NheⅠ-F+HRAS-R1引物和HRAS-F1+HRAS-Hin dⅢ-R引物分别扩增HRAS（V112A）的1～440 nt片段和44～570 nt片段，切胶回收PCR产物并混合作为模板，以HRAS-NheⅠ-F和HRAS-Hin d Ⅲ-R 引物扩增全长 HRAS（V112A）（570 bp）。NheⅠ和Hin d Ⅲ双酶切PCR产物及pCDNA3.1（+）质粒，4℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取重组质粒测序，获得pC-HRAS（V112A）重组质粒。

1.3 HRAS（V112A）定点突变

按照文献方法[7]，采用定点突变PCR方法，对HRAS（V112A）的12、13和61位密码子分别进行G12C、G13C和Q61R点突变及3个位点联合突变。简要描述如下：①配制50μL突变体系，含1μL pC-HRAS（V112A）、2 pmol混合突变引物（针对突变位点的正/反向突变引物，如：RM-G12C-F和RM-G12C-R各1 pmol混合）、25 μL 2×Primer Start Premix。②突变PCR。95℃变性5 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃扩增12 min，25个循环；72℃延伸10 min。③模板质粒降解，PCR产物中加入1μL Dpn I酶37℃消化过夜。④突变质粒转化。消化产物转化DH5α，挑克隆测序，根据测序结果选取在目的位置含有设计突变的克隆，根据突变类型，将质粒分别命名为 pC-HRAS（V112A/G12C）、 pC-HRAS（V112A/G13C）、pC-HRAS（V112A/Q61R）和 pC-HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）。

1.4 Western blot检测HRAS（V112A）及其突变体表达

按照说明书操作，各质粒使用Lipofectamine 2000瞬时转染6孔板中的L929细胞，转染后48 h刮取细胞并使用预冷PBS洗涤细胞2遍后重悬于0.25 mL PBS中。细胞悬液中加入1/5体积6×SDS加样缓冲液煮沸5 min，13 000 r/min离心10 min，取上清10%SDSPAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，以抗GAPDH抗体检测GAPDH为内对照，抗人HRAS抗体检测HRAS（V112A）的表达；肿瘤组织中HRAS蛋白表达的Western blot检测中，按照文献方法进行样品处理[8]，用剪刀取1 g病变组织剪碎至乳糜状，置于1 mL PBS中煮沸5 min，13 000 r/min离心10 min，取上清用于Western blot检测。

1.5 质料提取及小鼠体内接种、观察及分析

按质粒大提试剂盒说明书操作，提取含HRAS（V112A）及点突变的质粒，溶解于生理盐水，紫外分光光度法测定浓度，根据检测结果质粒浓度调整至2 mg/mL。取6～8周龄雌性NIH小鼠，每组8只，分别于左侧腋下按每只100μg（50μL）皮内注射pC-HRAS（V112A）[HRAS（V112A）组]、pC-HRAS（V112A/G12C）[HRAS（V112A/G12C）组]、pC-HRAS（V112A/G13C）[HRAS（V112A/G13C）组]、pC-HRAS（V112A/Q61R）[HRAS（V112A/Q61R）组]、 pC-HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）[HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）组]和生理盐水（对照组）。注射后于正常条件下饲养，定期观察注射部位及全身病变情况。

1.6 病变组织中HRAS基因的PCR检测

病变组织中DNA的分离采用文献中的煮沸法[9-10]，简要描述如下，质粒注射后4个月，取1 g病变组织剪刀剪碎至乳糜状，置1 mL PBS中煮沸5 min，13 000 r/min离心10 min，取1μL上清作为模板，使用HRAS-NheⅠ-F和HRAS-R1引物扩增HRAS 1～440 nt片段，切胶回收后连接pMD-18T载体测序。

2 结果

2.1 HRAS（V112A）的克隆和突变

以DiFi细胞cDNA为模板，PCR扩增HRAS，将扩增产物插入真核表达质粒pCDNA3.1（+）并测序，测序结果与人 HRAS 基因（Access Number：AB451336）比对，扩增的HRAS在335 nt位发生G-C突变，导致其112位的Val突变为Ala（V112A）。为排除聚合酶错配导致的突变，再次扩增，该突变仍然存在，将含有V112A 突 变 的 HRAS 基 因 命 名 为 HRAS（V112A）。以HRAS（V112A）为模板，使用Site-directed PCR突变[7]方法对设计位点进行突变，测序结果表明各HRAS（V112A）突变体均在设计位置含有预期突变，Blast及测序比对结果见图1。

2.2 重组质粒在L929细胞中的表达

以pCDNA3.1（+）空质粒作为对照，含HRAS（V112A）及其突变体的重组pCDNA3.1（+）质粒转染L929细胞，转染48 h后收取细胞进行Western blot检测，检测结果见图2A。本研究Western blot检测使用抗HRAS抗体购自中杉金桥公司，为OriGene产品，虽然抗体所用的免疫原为全长重组人HRAS蛋白，但该抗体与小鼠HRAS蛋白有交叉反应，因此对照细胞（泳道1）21 kD位置有较弱的阳性显色条带，但显色强度显著弱于质粒转染细胞。pC-HRAS（V112A）、pC-HRAS（V112A/G12C）、pC-HRAS（V112A/G13C）、pC-HRAS（V112A/Q61R）和 HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）转染细胞中，21 kD位置均有HRAS强显色条带。Western blot检测中HRAS均显示为2～3条带，且G12C突变HRAS的电泳迁移速率慢于野生型，而Q61R突变HRAS的迁移速率快于野生型，该现象与文献[11-12]的报道结果相同，证明本研究中的重组质粒能够在细胞内正确表达HRAS（V112A）及其各突变体。目前尚未见报道Gly13突变HRAS的电泳迁移速率变化情况，本研究中，G13C突变同G12C突变的HRAS（V112A）的迁移速率相近，均慢于HRAS（V112A）。HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）的迁移速率慢于 HRAS（V112A/Q61R），但快于 HRAS（V112A）、HRAS（V112A/G12C）和HRAS（V112A/G13C）。

图1 HRAS（V112A）的Blast结果及各突变体测序结果

2.3 小鼠体内致瘤结果

各质粒于腋下位置皮内注射NIH小鼠后3个月，HRAS（V112A）组 和 HRAS（V112A/Q61R）组 分 别 有 4 只（50%）和1只（12.5%）小鼠于注射部位出现病变，小鼠噬咬导致脱毛和皮损（图 3A），HRAS（V112A/G12C）组、HRAS（V112A/G13C）组和 HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）组小鼠均未出现明显病变。HRAS（V112A）组中，4只小鼠注射部位皮肤变厚呈增生样改变，皮肤表面出现麦粒大小疣状物，取1只小鼠处死后剪取病变皮肤测量，增生物体积约0.8 cm×0.4 cm×0.3 cm，外有包膜包裹，无明显新生血管穿透包膜（图3B）。剩余3只出现增生样改变的小鼠在注射后5个月，病变自行消退。HRAS（V112A/Q61R）组中，1只小鼠在注射后4个月于注射部位生成肿瘤，体积约4.8 cm×2.2 cm×1.8 cm（图3C），解剖后可见肿瘤外有包膜包裹，新生血管穿过包膜进入肿瘤内部（图3D），肿瘤中心部位呈糜样坏死，坏死部分约占肿瘤体积1/3。制备切片后进行病理学检查可见，核浆比增大，细胞核大小形态及染色深浅不一（图4），表现为恶性肿瘤样病理改变。小鼠体内致瘤试验证明，每只小鼠单独皮内注射100μg的pC-HRAS（V112A/Q61R）质粒可在NIH小鼠体内诱导形成肿瘤。

图2 Western blot检测HRAS（V112A）及突变体在L929细胞中的表达

2.4 病变组织中HRAS基因的表达和测序

采用PCR和Western blot方法检测HRAS（V112A）组和HRAS（V112A/Q61R）组小鼠病变组织中HRAS核酸序列和蛋白表达情况。PCR可在病变组织中扩增出阳性条带，回收扩增产物连接T载体测序，HRAS（V112A）组和HRAS（V112A/Q61R）组分别挑取10个和3个重组克隆送测序。测序结果表明，扩增产物的核苷酸序列均与各组注射的HRAS基因序列对应（比对结果见图5）。通过比对可以发现，HRAS（V112A）组增生样组织和HRAS（V112A/Q61R）组肿瘤组织中扩增的HRAS序列均含有V112A突变，10个HRAS（V112A）组HRAS扩增序列中均不含G12C、G13C和Q61R突变，而3个HRAS（V112A/Q61R）组HRAS扩增序列中仅含有Q61R突变。值得注意的是，40%的HRAS（V112A）组HRAS序列和33%的HRAS（V112A/Q61R）组HRAS序列中含有除设计位点以外的其他突变，该现象在肿瘤组织已有报道，可能为肿瘤组织中细胞微环境紊乱和异常增生导致的基因突变所致[13-14]。

Western blot检测病变组织中HRAS的表达，分别取HRAS（V112A/Q61R）组小鼠肿瘤的实体、坏死组织、HRAS（V112A）组小鼠增生样病变组织进行Western blot检测，上述组织泳道中21 kD位置均有明显HRAS显色条带，而对照组小鼠皮肤泳道中HRAS条带显色强度显著弱于上述组织（图6）。Western blot检测的结果可 见 ， HRAS（V112A/Q61R）仍 然 显 示 出 较 HRAS（V112A）更快的迁移速率，说明肿瘤组织中的HRAS基因在61位氨基酸位置存在突变。结合PCR和Western blot结果，可以认定HRAS（V112A/Q61R）组中肿瘤发生与注射pC-HRAS（V112A/Q61R）质粒相关。

图3 HRAS（V112A）组及HRAS（V112A/Q61R）组小鼠病变

图4 pC-HRAS（V112A/Q61R）诱发肿瘤的病理学检查结果

图5 小鼠肿瘤中扩增HRAS的测序结果

3 讨论

RAS基因（包括KRAS、NRAS和HRAS）的突变与肿瘤有密切的关系，在约15%的人类肿瘤中，可检测到RAS基因的突变，特别是在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中，突变RAS的检出率分别可达90%、50%和30%。常见的RAS基因突变位点为12和13位密码子，占比约80%和17%，61位密码子突变占比不足4%，在每个突变位点又存在多种突变形式[2]。本研究中，根据文献报道选取G12C、G13C、Q61R以及3个位点联合突变的HRAS（V112A）作研究对象，分析不同突变体能否在小鼠体内诱导肿瘤[15]。本研究中，从人结肠癌细胞系DiFi中扩增HRAS含有V112A突变，该突变在之前的文献报道中从未出现，但也有文献报道除常见的12、13、61位氨基酸突变外，HRAS可含有其他与癌症相关的罕见突变类型，如 12（G）11 等[16]。Crowder等[17]在人多发性骨髓瘤细胞系OPM-2中检测到K117V突变，该突变位点位于HRAS蛋白的GTP结合位点附近，展现出比G12V突变更强的转化活性。与之前使用单独的T24-HRAS不能在小鼠体内诱发肿瘤的结果不同，本研究中，单独HRAS（V112A/Q61R）的表达即可在NIH小鼠中诱发肿瘤的发生，该结果可能部分归因于V112A突变赋予HRAS更强的致瘤活性。

HRAS的信号转导功能由两个蛋白进行调节：鸟苷酸转化因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）促进HRAS与GDP的解离并与GTP结合，启动HRAS介导的激活信号转导；而GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）则可激活 HRAS 的GTP酶活性，将GTP降解为GDP，关闭信号传导。若HRAS突变后使其GTP酶活性降低，则可延长激活信号的持续时间，增强细胞增殖能力，从而诱发肿瘤。HRAS蛋白的GTP酶活性依赖于两个结构域：位于1～86 AA的SwitchⅡ结构域和位于87～171 AA的Helix 3结构域[18]（图7）。GAP的精氨酸手指可借助电荷作用伸入HRAS的内部与SwitchⅡ结合，提供正电荷稳定GTP水解过程中产生的负电荷，增强HRAS的GTP酶活性[19]。若HRAS第12位氨基酸由比移值（Rate of flow，Rf）为0.30/0.06的疏水性较弱的Gly突变为疏水性较强的氨基酸，如：Ile（Rf=0.79/0.57）、Val（Rf=0.67/0.32）和 Leu（Rf=0.77/0.52），可影响 HRAS 与 GAP 的结合，降低HRAS的GTP酶活性，延长激活信号的作用时间，促进细胞增殖；如果突变为疏水性较弱的Pro（Rf=0.48/0.16）或极性氨基酸，则不会影响/增强HRAS与GAP结合，不影响/增强HRAS的GTP酶活性[20-23]，缩短激活信号的作用时间，抑制细胞增殖。当前关于G13突变的文献报道较少，但结构研究表明G13也位于HRAS的GTP酶活性结构域，因此可以推测G13突变对HRAS GTP酶活性的影响与G12相同[24]。根据上述分析，本研究中采用的G12C和G13C突变均为使用极性更强的非水解的极性氨基酸Cys（Rf=0.08/0.02）替代弱极性的Gly，增强HRAS与GAP的结合，从而会增强HRAS的GTP酶活性，因此G12C和G13C突变可能反而降低了HRAS（V112A）的致瘤活性。根据上述讨论，也就可以理解在HRAS（V112A）组出现增生样病变的情况下，HRAS（V112A/G12C）、HRAS（V112A/G13C）和含有上述两个突变的HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）组小鼠中均未出现明显病变。HRAS蛋白通过61位Gln的氨基基团形成氢键与GAP的精氨酸指结构作用[25-26]，使用Arg替代Gln后，产生静电斥力，降低HRAS与GAP的相互作用，降低HRAS的GTP酶活性，因此HRAS（V112A/Q61R）展现出更强的致瘤能力。

图6 Western blot检测HRAS（V112A）及突变体在NIH小鼠病变组织中的表达

图7 HRAS蛋白3D结构示意图[18]

之前文献报道中，使用分别表达T24-HRAS和cMYC的质粒混合后注射的方式，每只小鼠注射剂量为12.5μg时，成年和新生小鼠中的致瘤率分别为20%和82%，但单独使用的T24-HRAS表达质粒未能在小鼠体内诱导肿瘤形成[4-5]。本研究中，当每只注射剂量为100 μg时，pC-HRAS（V112A/Q61R）在成年NIH小鼠中的的致瘤率为12.5%，该致瘤率虽然低于国外文献报道，但首次在单独使用HRAS表达质粒的条件下，在NIH小鼠体内诱导肿瘤形成。