异烟肼通过ROS/Casp ase-3信号通路诱导L-02细胞凋亡及槲皮素的保护作用

陈廷玉，王东伟，张金波，王 伟，王景涛，盛颜良，卢春凤*

（佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007）

异烟肼（isoniazid，INH）是临床上治疗结核病的首选药物[1]，但因其具有严重的肝毒性[2-3]，临床应用受到了极大的限制。到目前为止，INH的肝毒性机制尚未阐明，因此，阐明其肝毒性机制并寻找安全有效的保肝药物具有重要的意义。槲皮素（quercetin，Que）是一种天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗肝纤维化、抗氧化和清除自由基等多种作用[4-6]，是具有临床应用前景的抗氧化剂。前期研究发现，INH能诱导肝细胞发生DNA损伤，槲皮素对其具有保护作用[7-8]。因此，本实验以人正常肝细胞（L-02细胞）为研究对象，从细胞水平研究INH肝细胞毒性机制，重点探讨ROS/Caspase-3信号通路在INH诱导L-02细胞凋亡中的作用及槲皮素的保护效应，以期为临床寻找安全有效的防治INH肝毒性的药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂

L-02细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；异烟肼、槲皮素、Rho-123和DCFH-DA均为Sigma公司产品；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Hoechst33258染色试剂盒为杭州碧云天公司产品；兔抗Caspase-3多克隆抗体为Santa Cruz公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及试验分组 L-02细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液常规培养，镜下观察细胞生长情况，取对数生长期的细胞进行试验。将L-02细胞随机分为4组：对照组，给予等体积的无血清培养基；INH组，给予10 mmol/L INH；25μmol/L槲皮素组，给予10 mmol/L INH和25μmol/L槲皮素；50μmol/L槲皮素组，给予10 mmol/L INH和50μmol/L槲皮素。

1.2.2 MTT法检测L-02细胞存活率 L-02细胞经上述处理24 h后，吸弃培养液，每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20μL，放入CO2体积分数为5%的培养箱中继续孵育4 h。吸弃96孔板内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡10 min，使蓝紫色结晶完全溶解。使用酶标仪测定570 nm处的吸光度值D（570），计算细胞相对存活率。

1.2.3 细胞上清液中LDH活性检测 L-02细胞经上述处理24 h后，吸取细胞培养液，离心，取上清液100μL，加入50μL蒸馏水和250μL基质缓冲液，混匀，37℃水浴15 min后，加入250μL 2，4-二硝基苯肼，混匀，37℃水浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH 2.5 mL，室温放置3 min后，用酶标仪在440 nm处测其吸光度值D（440）。按下列公式计算细胞LDH活性。

1.2.4 Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡 L-02细胞经上述处理24 h后，吸弃培养液，用PBS洗2次，加入固定液500μL，4℃固定10 min，吸弃固定液，用PBS洗2次。然后加入Hoechst 33258染色液500μL，避光染色5 min。弃去染色液，用冷PBS洗2次，加抗荧光淬灭剂，封片。采用激发波长350 nm，发射波长460 nm，在荧光显微镜下观察、拍照，并计算细胞凋亡率。

1.2.5 细胞线粒体ROS水平的检测 收集各组细胞，用差速离心法分离线粒体，加入DCFH-DA，使其终浓度为2μg/mL，37℃、CO2体积分数为5%的培养箱中继续孵育20 min。吸去培养液，用冷PBS洗3遍，并弃去残液，以去除非特异性荧光，然后在荧光显微镜下观察细胞内DCF荧光强度并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行荧光强度分析，并计算平均荧光强度。

1.2.6 细胞线粒体膜电位的检测 收集各组细胞，用差速离心法分离线粒体，加入Rhodamine123染色液，使其终浓度为5 mg/L，37℃、CO2体积分数为5%的培养箱内避光孵育20 min；冷PBS洗3遍去除非特异性荧光后，用激光共聚焦测定激发波长488 nm下的荧光强度值，并拍照。利用Image-Pro Plus 6.0软件进行荧光强度分析，并计算平均荧光强度。

1.2.7 Western blot法检测细胞中Caspase-3蛋白表达 L-02细胞经上述处理24 h后，收集细胞，提取细胞蛋白，用BCA法进行蛋白定量。每孔上样10 μg总蛋白，在12%SDS-PAGE中进行电泳分离，然后转到PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭2 h后，加入用封闭液稀释的一抗，室温孵育1 h，然后4℃冰箱过夜。TBST洗膜后，加入用封闭液稀释的二抗，室温孵育1 h。再用TBST洗膜，在暗室中用Super ECL进行化学发光，X线胶片曝光显影。扫描胶片，用Quantity One 4.6.2图像分析软件对目标蛋白进行分析，以β-actin作为内参。

1.3 统计学分析

数据以xˉ±s表示。应用SPSS 11.0软件进行统计分析。INH组与对照组比较，采用两组间t检验，给药组与INH组比较采用ANOVA进行分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 L-02细胞存活率

L-02细胞存活率检测结果见图1，L-02细胞经INH处理24 h后，细胞的存活率明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；50μmol/L槲皮素组细胞存活率明显增加，与INH组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 L-02细胞上清液中LDH活性

L-02细胞上清液中LDH活性检测结果见图2，INH组细胞上清液中LDH活性显著高于对照组（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素组细胞上清液中LDH活性明显低于INH组（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制细胞LDH的漏出，且50μmol/L槲皮素组抑制作用更显著。

图1 L-02细胞存活率

图2 L-02细胞上清液中LDH活性

2.3 L-02细胞凋亡率

L-02细胞凋亡率检测结果见图3，L-02细胞经INH处理24 h后，细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素组细胞凋亡率明显低于INH组（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制L-02细胞凋亡，且50μmol/L槲皮素组抑制作用更显著。

图3 L-02细胞凋亡率

2.4 L-02细胞线粒体ROS水平

结果见图4，与对照组比较，INH组L-02细胞线粒体ROS水平显著升高（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素组ROS水平明显低于INH组（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素可抑制细胞线粒体ROS的生成，且50μmol/L槲皮素组抑制作用更显著。

图4 L-02细胞线粒体ROS水平

2.5 L-02细胞线粒体膜电位

L-02细胞线粒体膜电位检测结果见图5，与对照组比较，INH组L-02细胞线粒体ΔΨm显著降低（P＜0.01）；25和50μmol/L槲皮素组细胞线粒体ΔΨm明显升高，与INH组比较差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素对细胞线粒体有保护作用，且50 μmol/L槲皮素组的保护作用更明显。

图5 L-02细胞线粒体膜电位

2.6 L-02细胞Caspase-3蛋白表达

Western blot检测细胞中Caspase-3蛋白表达的结果见图6，INH组细胞Caspase-3蛋白表达显著高于对照组（P＜0.01）；25和50 μmol/L槲皮素组细胞Caspase-3蛋白表达明显低于INH组（P＜0.05或P＜0.01），表明槲皮素能抑制Caspase-3蛋白表达，且50μmol/L槲皮素组抑制作用更显著。

图6 L-02细胞Caspase-3蛋白表达

3 讨论

迄今为止，INH肝毒性的具体机制尚未阐明。研究表明，线粒体是多种外源化合物细胞毒性的主要靶点，也是细胞ROS产生的主要场所[9-12]。近年来，线粒体在细胞凋亡机制研究中的作用越来越受到关注[13-14]。因此，本实验以L-02细胞为研究对象，从细胞凋亡的角度探讨INH肝细胞毒性的机制，重点探讨ROS/Caspase-3信号通路在INH诱导L-02细胞凋亡中的作用，以及槲皮素对INH所致肝细胞凋亡的保护效应及其机制。本实验发现，INH处理L-02细胞后，细胞凋亡率明显增加，而槲皮素能明显降低细胞凋亡率，表明INH能诱导L-02细胞凋亡，槲皮素对INH诱导的L-02细胞凋亡具有保护效应。

研究表明，在细胞凋亡发生时，线粒体的结构和功能会发生明显变化，表现为线粒体膜通透性增高，线粒体ΔΨm降低[15]。那么INH诱导L-02细胞凋亡是否与ROS介导的线粒体损伤有关？本实验检测了细胞存活率[16]、LDH漏出量及线粒体ΔΨm值。正常情况下LDH存在于细胞内，只有当细胞膜损伤时，它才能释放出来，LDH释放或漏出是反映细胞膜受损的重要指标，LDH漏出量的多少可间接反映细胞受损的程度[17-19]。线粒体ΔΨm是反映线粒体功能的关键指标，线粒体ΔΨm降低，提示细胞发生线粒体损伤。本实验结果显示，INH处理后L-02细胞存活率明显降低，LDH漏出明显增加；而槲皮素能明显增加L-02细胞存活率，使细胞LDH漏出减少。同时，还发现INH作用L-02细胞后，线粒体ΔΨm明显降低，而槲皮素可使细胞线粒体ΔΨm明显升高，表明INH可导致细胞线粒体损伤，使膜通透性增加，促进LDH漏出；槲皮素对线粒体损伤有一定的保护作用[20]，使膜通透性降低，进而减少LDH的漏出。线粒体ΔΨm降低是细胞凋亡的主要事件，线粒体ΔΨm下降可导致线粒体膜通透性增加，激活线粒体细胞凋亡途径，诱导细胞凋亡，最终导致细胞损伤[21-23]。本实验发现，L-02细胞经INH处理后，细胞中Caspase-3蛋白表达上调，而槲皮素作用后能明显下调Caspase-3蛋白表达，表明INH能造成L-02细胞线粒体损伤，激活Caspase凋亡蛋白酶，启动细胞线粒体凋亡途径，诱导L-02细胞凋亡；槲皮素可保护线粒体膜，阻断线粒体细胞凋亡途径[24]，抑制L-02细胞凋亡的发生。那么INH是如何导致细胞线粒体ΔΨm降低，诱导细胞凋亡？研究表明，ROS的增加可损伤细胞线粒体膜，导致细胞线粒体ΔΨm降低，诱导细胞凋亡发生[25-26]。因此，本实验进一步检测了线粒体ROS水平，结果发现L-02细胞经INH处理后，线粒体ROS水平显著升高，而槲皮素能降低线粒体ROS水平，提示INH能促进线粒体ROS生成，降低细胞线粒体ΔΨm，诱导细胞凋亡；槲皮素可减少线粒体ROS的生成，增高细胞线粒体ΔΨm，抑制ROS/Caspase-3信号通路诱导的细胞凋亡，保护细胞免受损伤。

总之，在本实验条件下，INH能诱导L-02细胞发生凋亡，ROS/Caspase-3信号通路参与了其凋亡的过程；而槲皮素对INH诱导的L-02细胞凋亡具有保护作用，其机制可能是通过抑制ROS释放，改善线粒体功能，抑制ROS/Caspase-3信号通路阻断线粒体细胞凋亡途径，从而抑制L-02细胞凋亡，但具体作用机制还有待于进一步研究。