枸杞多糖对脊髓神经细胞辐射损伤后的保护作用研究

关素珍，德小明，庞克华，杨惠芳*

（宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业卫生与环境卫生学系，宁夏 银川 750001）

电离辐射广泛存在于自然界，一定剂量的射线可以对人体造成伤害。因射线看不到、摸不着，经常被忽视，只有给人们带来巨大损害时才意识到。因此，寻找一些对辐射损伤具有保护作用的药物非常重要。研究表明，中药类多糖对于机体受到辐射损伤能起到较好的恢复作用[1]，而枸杞多糖（lyceum barbarum polysaccharide，LBP）是从中草药枸杞中提取出来的一种高含糖类成分[2]，其对辐射所导致的损伤是否具有保护作用值得探究。因此，本实验建立体外X射线照射脊髓神经（spinal cord nerve，SCN）细胞的损伤模型，研究LBP干预对辐射损伤模型的保护作用并检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达的情况，为LBP抗辐射损伤的机制研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 脊髓神经细胞的培养及转移

大鼠SCN细胞原代培养于培养基内（DMEM+9%的胎牛血清+1%的青霉素-链霉素配置的细胞培养液），置CO2体积分数为5%、37℃培养箱内静置培养，次日更换培养基，进行复苏、传代及冻存后，实验进行时弃去细胞培养液，PBS清洗两次，加入0.5 mL的0.25%胰蛋白酶，在显微镜下观察，待所有细胞悬浮起来时加入等量的细胞培养液后，用移液管吹打，然后将培养瓶中的细胞液转入离心管中，以800 r/min离心5 min，去除上清，加2 mL PBS将细胞清洗1遍，1 000 r/min再次离心3 min，去除上清加入新的培养基，将细胞接种到6孔板中，培养1 d，待细胞贴壁后用于制备SCN细胞辐射损伤模型。

1.2 SCN细胞辐射损伤模型的建立

采用直线加速器，分别用低（2 Gy）、中（6 Gy）、高（10 Gy）剂量的X射线辐射干预SCN细胞，剂量率为500 cGy/min，同时设立正常对照组（不经X射线辐射），各组细胞于培养箱中培养24 h后进行后续检测。

1.3 MTT法检测X射线辐射对SCN细胞活性的影响

培育24 h后，每孔加入四甲基噻唑蓝（tetramethylthiazole blue，MTT）20 μL 继续培养 4 h，使MTT被还原为甲臜。吸出每孔中的液体，加入150 μL DMSO使甲臜消融。再置摇床上缓慢摇匀10～15 min，使用酶标仪测定每孔的光密度D（550）值，计算细胞的存活率。

细胞存活率=[D（550）实验组-D（550）空白组]/[D（550）对照组-D（550）空白组]

1.4 MTT筛选最适的LBP浓度

筛选实验分为5组即空白组（细胞培养液），辐射组（10 Gy X射线照射），辐射+LBP组（共3个剂量，X射线照射后，分别调整LBP浓度至10、25、40 mg/L），各组培养24 h后采用MTT法检测细胞的存活率，方法同1.3。

1.5 LBP对辐射损伤SCN细胞模型自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达的影响

采用免疫组化及Western blot检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ的表达，用IPP 6.0软件测定免疫组织化学的光密度值，用Image J分析测定Western blot条带的灰度值。

1.6 统计学处理

采用SPSS 17.0对数据进行统计学分析，所有数据用xˉ±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较选用LSD-t检测。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 MTT检测不同辐射剂量X射线对脊髓神经元的影响

2、6、10 Gy X射线照射后SCN细胞的存活率分别为（85.00±3.91）%、（70.00±1.63）%和（49.25±7.59）%，和正常对照组[（100.00±3.46）%]比较明显降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。可见X射线能明显降低SCN细胞的活性，且随着射线剂量的增高，SCN细胞活性降低，10 Gy照射后SCN细胞活性较2和6 Gy组明显降低（P＜0.05），故本课题后续实验选择剂量为10 Gy建立脊髓神经细胞辐射损伤模型。见图1。

图1 不同辐射剂量X射线对脊髓神经元的影响

2.2 LBP对辐射诱导SCN细胞存活率的影响

辐射组的细胞存活率与正常对照组比较明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。10、25、40 mg/L浓度的LBP干预后，细胞的存活率分别为（57.25±3.09）%、（60.25±5.56）%、（70.25±2.87）%，与辐射组[（49.25±7.59）%]相比明显升高，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。LBP 40 mg/L组细胞活性最高，且与10和25 mg/L比较明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），所以选择40 mg/L的LBP作为药物干预浓度进行后续实验。见图2。

图2 LBP对辐射诱导SCN细胞存活率的影响

2.3 LBP对辐射损伤SCN细胞的自噬相关蛋白LC3 II/I表达的影响

免疫组化和Western blot检测结果见图3、图4和表1，均显示与正常对照组相比，辐射组细胞的自噬相关蛋白LC3 II/I表达明显增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与辐射组相比，LBP+辐射组细胞LC3 II/I蛋白表达亦明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

电离辐射作用于组织时可引起光电效应、康普顿效应和电子对效应等[3]。因细胞中含有的重要成分为水分和蛋白质，当射线照射细胞可引起蛋白质变性，发生电离，主要是去氧核糖核酸的结构断裂，细胞的形态发生改变，引起自身死亡和突变等。动物脊髓神经细胞因其是永久细胞，细胞特殊的稳定性为实验提供了保障[4]。已有研究表明，SCN细胞当受到外界刺激时，比其他细胞更容易发生自噬[5]，因此本实验选用SCN细胞株作为研究对象。

图3 免疫组化检测辐射损伤SCN细胞自噬相关蛋白LC3 II/I的表达

图4 Western blot检测SCN细胞自噬相关蛋白LC3 II/I的表达

表1 LBP对辐射损伤SCN细胞自噬相关蛋白LC3 II/I表达的影响s）

表1 LBP对辐射损伤SCN细胞自噬相关蛋白LC3 II/I表达的影响s）

与对照组比较，*P＜0.05；与辐射组比较，#P＜0.05.

Western blot条带灰度值1.02±0.12 1.71±0.16*2.16±0.22*，#组别对照组10 Gy X射线辐射组10 Gy X射线辐射+40 mg/L LBP组免疫组化光密度值1.48±0.48 7.20±0.76*13.50±2.36*，#

射线广泛存在我们周围，医院内直线加速器产生的X射线剂量容易控制，且操作简单，因此选用此方式照射SCN细胞建立辐射损伤模型，具有重复性好、稳定性高等优点，近些年被普遍应用于建立辐射损伤模型。本实验用（2、6、10 Gy）3个剂量梯度的X射线损伤SCN细胞，在恒温培养箱中培养24 h，在显微镜下观测到随X射线剂量的不断增加，细胞核固缩，细胞变圆、变小。10 Gy剂量X射线照射所造成SCN细胞存活率明显降低，约为正常对照组的50%，所以本实验选择此剂量的X射线来建立SCN细胞辐射损伤模型。

关于辐射损伤的保护性药物很多，有谷氨酸拮抗剂、神经营养性物质和各种抗氧化剂等，但大部分效果并不理想。中药类多糖对于机体受到辐射损伤能起到较好的恢复作用，枸杞多糖又是从中草药枸杞中提取出来的一种高含糖类营养成分。自噬相关蛋白LC3是自噬体膜上的标志性蛋白，当自噬启动后，胞质型LC3 I转化到自噬体膜LC3 II，LC3 II/I越大，表明细胞自噬越高。大量文献表明辐射损伤可以诱导自噬，如杨文军等[6]用不同剂量的60Co照射小鼠精母细胞后继续培养24 h，辐射组中电镜可以观察到大量的自噬小体，自噬蛋白LC3表达量增高，因此，辐射可以诱导自噬在精母细胞中发生。张志敏等[7]用射线处理HeLa细胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ表达与辐射剂量成正比关系，均提示在未达到致死剂量时，电离辐射是可以诱导自噬的。本实验也充分证明这一观点，当用10 Gy剂量X射线照射SCN细胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平在照射组明显高于正常对照组。文献报道LBP具有诱导细胞发生自噬的作用，如张多强等[8]研究表明LBP诱导自噬作用对肝癌细胞的凋亡起保护作用，促进肝癌细胞的增殖；姜鸣等[9]研究表明LBP可以诱导LC3 I向LC3 II转化，诱导细胞发生自噬。本实验研究结果显示辐射+LBP组细胞的LC3 II/I表达量较辐射组明显升高，提示LBP可以诱导自噬蛋白LC3 II/I的表达。

综上所述，我们采用X射线辐射SCN细胞建立损伤模型，研究发现LBP对辐射造成的SCN细胞损伤具有保护作用，同时，发现LBP能够促进由辐射损伤所致的SCN细胞发生自噬，其保护作用机制可能与LBP促进自噬相关蛋白LC3 II/I表达有关，本研究进一步提示LBP具有一定的抗辐射作用。