碳氮比对真菌发酵桑枝燕麦麸皮的活性成分和抗氧化能力的影响

王 倩,张佳婵,王昌涛,*,王守现,赵 丹,王亚琳

(1.北京工商大学，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048;2.北京市农林科学院植物保护环境保护研究所，北京市食用菌工程技术研究中心,北京 100097;3.云南白药集团股份有限公司,云南昆明 650504)

据《本草纲目》记载,桑枝味苦性平,有祛风除湿、通经活络、化气行水等功效。其含有多种活性成分,在降血糖、降血脂、抗氧化等方面拥有极高的应用价值[1]。燕麦麸皮简单加工后就可富集25%的燕麦β-葡聚糖,燕麦β-葡聚糖是一种水溶性膳食纤维,在降血脂、降血糖及提高免疫力,维持肠道菌群平衡等方面表现优异[2]。另外,其还可作为化妆品的有效成分,提高皮肤抗过敏能力,延缓皮肤衰老等。可广泛用于食品、保健品、化妆品等行业。

药食用真菌具有调节免疫、降血糖、降血压、降胆固醇、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等多种保健功效[3-4]。其中韩芝(Ganodermalucidum)、猴头菌(Hericiumerinaceus)、桑黄(Phellinusigniarius)以及奥德蘑(Oudemasiellapudensas)在保健品方面具有较高的开发价值。研究表明:韩芝、猴头菌、桑黄以及奥德蘑具有增强机体免疫能力、抗氧化方面、抗肿瘤作用等功能活性[5-11],在食品、医药、保健等领域受到广泛关注。近年来,已有不少研究以桑枝或燕麦麸皮为基质栽培灵芝、猴头菌,桑黄等药食用真菌,但主要集中于开发新的培养基质,并未对其混合菌质的成分加以研究,并且对桑枝-燕麦麸皮联合使用的研究也较少。

双向固体发酵是以具备活性成分的物质为发酵基质,以药食用真菌为发酵菌种,定向控制所需发酵成分[12];而且基质在为真菌提供生长代谢所需营养成分的同时在真菌产生的酶作用下,其成分得到有效的分解或转化并与菌体及其代谢产物共同构成具有不同功能的新型菌质,从而使发酵具有了双向性,达到“1+1>2”的效果。本文以桑枝和燕麦麸皮为药性基质,利用双向固体发酵技术,在四种不同的碳氮比条件下,发酵韩芝、猴头菌、桑黄以及奥德蘑四种药食用真菌,评价其生长速度,并对最终得到的药性菌质进行活性成分含量的测定和抗氧化功效的分析,为药食用真菌在食品保健方面的开发和利用提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

韩芝、桑黄、猴头菌、奥德蘑、桑枝、燕麦麸皮 均由北京市农业科学研究院赠送;芦丁 中国药品生物制品检定所;无水葡萄糖、苯酚、浓硫酸、氢氧化钠、盐酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚、无水乙醇、30%双氧水、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)北京化工厂;硫酸铜、亚硝酸钠、硝酸铝、酒石酸钠、焦性没食子酸、邻二氮菲、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、碳酸钠 国药化学试剂公司;聚乙烯袋 北京半夏科技发展有限公司。

TB-214电子分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;JY3002电子天平 舜宇恒平科学仪器有限公司;KQ-300E数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;3-18K高速自动离心机 德国Sigma公司;HW·SY11-K电热恒温水浴锅 北京市长风仪器仪表公司;UVmini-1240紫外分光光度计 SHMADZU公司;SPX-250GB智能光照培养箱 上海跃进医疗器械有限公司;FW-80高速自动粉碎机 西安仪创实验室仪器设备有限公司;DHG-9030A电热恒温干燥箱 北京精科华瑞有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桑枝和燕麦麸皮的预处理 首先将桑枝按料水比1∶1.2 (g/g)加水进行预湿2 d,每天手动搅拌数次并覆盖塑料膜,保证桑枝尽可能均匀吸水进行预湿。按桑枝干料的2.2倍质量称取预湿后的桑枝,加入表1中相应质量的燕麦麸皮,最后加入燕麦麸皮干重1.2倍的水,用玻璃棒搅拌至均匀。

1.2.2 培养基的配制 碳氮比,是指有机物中总碳与总氮含量的比值,一般用“C/N”表示。根据青岛科标检测研究院有限公司检测数据知桑枝的碳含量为66%,氮含量为1%;燕麦麸皮的碳含量为43.96%氮含量为3.28%,通过计算得表1配料比。按照表1四种不同的碳氮比称取培养基,装入长为15 cm×6 cm的聚乙烯袋中,每袋150 g,加入1.48 g的食用碱,121 ℃下灭菌40 min,备用。

表1 桑枝和燕麦麸皮配比表Table 1 Ingredients ratio of mulberry and oat bran

1.2.3 平均生长速度的测定 培养基灭菌后每袋接入1 cm2斜面菌块,放入培养箱中于28 ℃下,避光培养10～20 d,不同真菌生长速度不同,直至菌丝长满培养基底部,发酵完全为止。每组设3个平行,湿度控制在60%左右。在菌丝开始生长处划线记为生长起点,培养一段时间后在菌丝体延伸所在处再次划线记为生长终点,测量菌丝的延伸长度,以其延伸长度记为生长速度,计算平均生长速度。

1.2.4 活性成分含量的测定 取1.2.3中的菌质于烘箱中烘干,粉碎机粉碎后过80目网筛即为待测样品,其中以未接种菌块的培养基在培养箱中于28 ℃下,避光培养10～20 d后所得菌质作为对照组。分别取2 g 样品加入16 mL 去离子水或80%乙醇,25 ℃ 300 W下超声提取1 h 后,在室温下10000 r/min离心10 min,过滤后取其上清液即为水提液或醇提液,对二者进行活性成分测定。

1.2.4.1 水提液中多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[13]法测定发酵后体系的多糖含量,以无水葡萄糖为标准物质,未发酵基质水提液为空白对照,含量以mg/g干物质表示;将待测样品稀释200倍后,取1 mL试样于试管中,加入0.5 mL 5%苯酚溶液混匀,再加入2.5 mL浓硫酸充分混匀,5 min后封管沸水浴1 h,取出冷却至室温后在490 nm处测其吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准曲线方程为:y=12.403x+0.0027,R2=0.9996。将样品所得吸光度带入标准曲线方程中得到样品浓度,按下式计算得出含量:含量=(样品浓度×稀释倍数×16)/2,1.2.4.2～1.2.4.4同。

1.2.4.2 水提液中多肽含量的测定 利用福林酚法[14]测定发酵前后体系多肽的含量,以牛血清蛋白为标准物质,未发酵基质水提液为空白对照,含量以mg/g干物质表示;将待测样品稀释20倍后,取1 mL试样于试管中,加入5 mL试剂甲迅速混合在25 ℃下水浴10 min,逐管加入试剂乙混匀,25 ℃水浴反应30 min后在700 nm处测吸光度。(试剂配制:试剂甲A:5 g Na2CO3+1 g NaOH+0.125 g酒石酸钾钠溶于500 mL去离子水;B:0.5 g硫酸铜溶于去离子水(50份A与1份B混合均匀。试剂乙:福林酚∶去离子水=1∶1)以牛血清蛋白浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准曲线方程为:y=0.5125x+0.1005,R2=0.9903。

1.2.4.3 醇提液中黄酮含量的测定 用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[15]测定发酵前后体系的黄酮含量,以芦丁为标准物质,未发酵基质醇提液为空白对照,含量以mg/g干物质表示;取稀释2.5倍后的待测样品溶液2 mL于10 mL容量瓶中,加入3 mL 30%乙醇溶液,随后加入5% NaNO2溶液0.3 mL,摇匀后静置6 min,再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液,摇匀静置6 min后加入4 mL 1 mol/L的NaOH溶液,加水定容至10 mL,摇匀放置15 min。在510 nm下测定吸光度。以芦丁浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准曲线方程为:y=5.8x+0.032,R2=0.9996。

1.2.4.4 醇提液中多酚含量的测定 按福林酚法[16]测定发酵前后体系的多酚的含量,以没食子酸为标准物质,未发酵基质醇提液为空白对照,含量以mg/g干物质表示。取稀释5倍后的待测样品溶液1 mL于10 mL容量瓶中,然后依次加入1 mL蒸馏水,0.5 mL福林酚溶液,1.5 mL 26.7% Na2CO3溶液,去离子水定容至10 mL,摇匀。室温下反应2 h,760 nm处测定其吸光度。以没食子酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得标准曲线方程为:y=1.473x-0.1074,R2=0.9909。

1.2.5 抗氧化能力测定 以1.2.4中得到的提取液对DPPH自由基和羟自由基的清除率作为其抗氧化能力的衡量标准,清除率越高,抗氧化能力越强。以未发酵基质的水提液与醇提液为空白对照,结果以百分比表示。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力测定 采用分光光度法[17]进行测定,取1.5 mL待测液与1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀记为A1管;取1.5 mL待测物溶剂与1.5 mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀记为A2管;取1.5 mL待测物溶剂与1.5 mL待测液混匀记为A2管,反应30 min后在517 nm处分别测定其吸光度。其清除率按下式计算。

清除率I(%)=(A2+A3-A1)×100/A2

不过笔者并不赞同过多地将“探究性”融入作文考察当中，对照这六条标准，江苏高考作文题在“探究性”方面是弱的。但其实反面想想，难道江苏不正因如此，才成就了其独特的“个性”吗？江苏高考语文一向提倡与赞扬记叙文文体，希望在高考作文中挖掘出优秀的记叙文，而因为在命题中“探究性”与“思辨色彩”的相对不强，才给了记叙文书写一定的“喘息空间”。如果作文材料思辨色彩过于浓厚，连命题人都想让学生去写议论文了，学生哪还能写出优秀的记叙文来呢？

1.2.5.2 羟自由基清除能力测定 羟自由基清除率则是采用铁氧化邻二氮菲法[18]进行测定。取0.5 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲于试管中,1 mL 0.15 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH=7.4),0.5 mL蒸馏水,充分混合。加入0.5 mL 0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液,混匀后加0.5 mL 0.01%双氧水,于37 ℃水浴60 min,在536 nm测吸光度,所得数值为损伤吸光度A1。以0.5 mL水替代损伤管中0.01% H2O2,操作同损伤管,得到未损伤吸光度A2,样品管以0.5 mL样品液代替0.01% H2O2,操作同损伤管,得到样品管吸光度A3。清除率计算如下:清除率(%)=(A3-A1)×100/(A2-A1)

2 结果与分析

2.1 碳氮比对菌丝生长速度的影响

碳氮比是药食真菌生长的重要因素。真菌菌丝的生长经历的延滞期、迅速生长期和衰退期三个阶段[19],不同阶段的生长速度不同,对碳氮比的要求不同。图1为四种药食用真菌菌丝在四种不同碳氮比下的生长状态。经测定和统计得到表2。从表2可以看出,不同的菌种对碳氮比的要求不同。随着碳氮比的增大,韩芝菌丝体洁白浓密度相当,平均生长速度无显著变化(p>0.05),但整体生长速度普遍高于其他三种真菌(p<0.05);猴头菌生长速度随碳氮比的增大呈上升趋势,在碳氮比为50∶1 (g/g)时,平均生长速度高达(2.75±0.24) mm(p<0.05),但是菌丝生长的洁白浓密度略低于其它碳氮比;桑黄在碳氮比为20∶1 (g/g)时生长速度显著低于其他碳氮比,且碳氮比30∶1～50∶1 (g/g)时生长速度无显著差异;奥德蘑在考察碳氮比范围内生长速度无显著性差异。

表2 碳氮比对四种真菌菌丝生长速度的影响Table 2 Effects of C/N ratio on mycelial growth rates of four edible fungi

图1 碳氮比对四种药食用真菌(韩芝A,猴头菌B,桑黄C,奥德蘑D)菌丝生长速度的影响Fig.1 Effects of C/N ratio on mycelial growth rate of four edible fungi(Ganoderma lucidum A,Hericium erinaceus B,Phellinus igniarius C,Oudemasiella radiate D)注:A、B、C、D每个图中的碳氮比从左到右依次为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 g/g。

菌丝的生长是靠菌丝尖端的生长点及其自身分解的基物酶,将大分子的物质分解成小分子的物质进入体内的。本次实验发现,高碳氮比时,四种菌种的生长速度较快,有利于大分子物质分解进入体内。而宋爱荣等[20]证明较高的氮含量对菌丝的生长有益,该结论与本实验结果不符。这可能与桑枝的特殊活性成分有关,邹湘月[21]等研究发现在液态培养基中添加桑枝水提物对桑黄生物量的增长有显著促进作用。说明菌丝体的生长应为多种物质共同作用的结果。

2.2 碳氮比对发酵菌质活性成分含量的影响

2.2.1 碳氮比对发酵菌质多糖含量的影响 碳氮比对发酵菌质多糖含量的影响见图2,从图2中可以看出,对照组多糖含量随碳氮比的增加而减小,这与基质中燕麦麸皮比例的降低有关;大部分实验组多糖含量高于相应对照组,是因为微生物菌丝体也富含多糖类物质,微生物生长将大分子淀粉类物质分解成小分子多糖,并逐渐转化为自身营养物质,从而使多糖更易被提取和检测[22]。并且,随着碳氮比的增加,四种真菌发酵后多糖的含量均有降低趋势但高于对照组。

图2 碳氮比对四种药食用真菌多糖含量的影响Fig.2 Effects of C/N ratio on polysaccharide contents of four edible fungi

除韩芝外,猴头菌、桑黄和奥德蘑菌质随着碳氮比的增加,其水提液中多糖含量呈下降趋势。韩芝在碳氮比为20∶1～40∶1 (g/g)呈下降趋势,在碳氮比为50∶1 (g/g)时多糖含量稍有上升,可能为在此碳氮比下基质中多糖已满足其菌丝体生长所需营养,自身生命代谢活动导致多糖含量增加;四种真菌在碳氮比为20∶1 (g/g)时,多糖含量最高,其中桑黄和奥德蘑最高可分别达到(132.80±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物质,约为发酵前水平的2倍,这与秦俊哲等[23]利用中药渣为培养基培养灵芝得到的灵芝菌丝中多糖和氨基酸含量均比子实体提高2倍以上的结论相似。这是因为,随着碳氮比的增大,微生物因生长而分解基质中的糖类物质,从而使多糖含量降低,此推论符合表2所得结果:随着碳氮比的增加,微生物生长速度呈上升趋势。

2.2.2 碳氮比对发酵菌质多肽含量的影响 碳氮比对发酵菌质多肽含量的影响见图3,随碳氮比的增加,韩芝菌质水提液中的多肽含量始终高于对照组,随着碳氮比的增加,多肽含量呈现先降低后升高的趋势,碳氮比为30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)时多肽含量较低;说明此碳氮比下韩芝将菌质中的多肽分解转化为小分子氮源,以满足自身生长需要,这也符合表2中韩芝在碳氮比为30∶1 (g/g)和40∶1 (g/g)时生长较快的结论。

图3 碳氮比对四种药食用真菌多肽含量的影响Fig.3 Effects of C/N ratio on polypeptide contents of four edible fungi

猴头菌、桑黄和奥德蘑菌质多肽含量随碳氮比的增加而均呈下降趋势,分别由(92.57±5.55)、(133.15±4.24)、(127.84±3.42) mg/g干物质,降低至(21.07±1.41)、(29.50±1.26)和(21.07±1.30) mg/g干物质;并且在较低碳氮比时,三种真菌的多肽含量高于对照组水平,其中在碳氮比为20∶1 (g/g)时,桑黄和奥德蘑多肽含量远高于对照组,随碳氮比的增长多肽含量逐渐低于对照组,可能是碳氮比增大,菌丝体大量生长,分解代谢氨基酸产生乙酰辅酶A,参与三羧酸循环,而氮元素含量较低,真菌维持自身生长所需多肽含量大于自身代谢所合成多肽量,使总体多肽含量降低。郭霞[24]在对桑黄的发酵过程中也发现氮源被大量利用参与菌丝和胞外多糖的合成,本实验结论与其相符。

2.2.3 碳氮比对发酵菌质黄酮含量的影响 碳氮比对发酵菌质黄酮含量的影响见图4,从图4中可知,韩芝在碳氮比为30∶1～50∶1 (g/g)时,黄酮含量高于对照组;猴头菌在碳氮比在20∶1～40∶1 (g/g)时黄酮含量高于对照组,且随碳氮比的增长逐渐降低;桑黄黄酮含量在碳氮比为30∶1 (g/g)时最高达(1.34±0.01) mg/g干物质;奥德蘑黄酮含量则随碳氮比的增加整体呈下降趋势,由(1.86±0.08) mg/g干物质下降至(0.66±0.01) mg/g干物质,下降了约2/3。

图4 碳氮比对四种药食用真菌黄酮含量的影响Fig.4 Effects of C/N ratio on flavonoids contents of four edible fungi

2.2.4 碳氮比对发酵菌质多酚含量的影响 碳氮比对发酵菌质多酚含量的影响见图5。从图5中可知,在碳氮比大于20∶1 (g/g)时,除韩芝外,其它三种真菌多酚含量均低于对照组;韩芝菌质多酚含量随碳氮比的增长总体呈先下降后增长趋势,在碳氮比为30∶1 (g/g)时达到最低,为(12.85±0.56) mg/g干物质;猴头菌与桑黄多酚含量趋势均为先下降后趋于平缓,奥德蘑多酚含量随碳氮比的增加先增长后下降最终趋于平缓,在碳氮比为30∶1 (g/g)时含量达到最高;与对照组相比猴头菌、桑黄和奥德蘑在碳氮比为50∶1 (g/g)时,多酚浓度在发酵后分别下降了(6.57±0.18)、(6.78±0.25)和(5.64±0.47) mg/g干物质,下降了约1/3。

图5 碳氮比对四种药食用真菌多酚含量的影响Fig.5 Effects of C/N ratio on polyphenols contents of four edible fungi

发酵菌质多酚含量低于对照组的原因,可能在破壁过程中木质素等大分子酚类物质在多种酶的作用下被转化利用合成了其它物质,因分解速率高于合成速率而呈现降低状态。此外,真菌在发酵过程中会产生自由基,自由基随真菌代谢大量积累,可能使多酚含量降低。Nitayapat等[28]在使用香菇类真菌发酵橘子渣时也发现多酚含量急剧下降。魏龙[29]在灵芝-当归双向发酵过程中发现,在发酵后的菌质中新检测出了9种化合物;此外发酵后有8种物质含量明显升高、8种物质含量明显降低,表明发酵基质在真菌的多种酶作用下进行了复杂的分解、转化与合成。敢小双[26]也表示灵芝在生长过程中代谢掉了原来的一些物质,使其含量减少或消失。

2.3 碳氮比对发酵菌质抗氧化活性的影响

2.3.1 碳氮比对发酵菌质DPPH清除率的影响 实验结果表明:发酵后水提液对于DPPH自由基几乎无清除能力。而发酵后醇提液与空白对照相比均有较好的清除能力,韩芝的自由基清除能力随碳氮比的增大先增强后减弱,在碳氮比为40∶1 (g/g)的时候达到了最大,最高清除率达到96.9%。实验结果与魏龙[29]发现灵芝当归双向发酵中,随着当归添加量的增加,发酵菌质的DPPH自由基清除能力均呈先上升后下降趋势的结果相似,说明韩芝的DPPH自由基清除率变化与发酵基质变化有很大关系。其它三种真菌发酵后的DPPH自由基清除能力均高于空白对照,并且随碳氮比的增长变化不大。实验结果表明,在发酵过程中,真菌代谢产生的酶将桑枝-燕麦麸皮中的有效成分充分的释放出来,并且自身产生了活性物质,使其抗氧化能力大大的上升。

图6 碳氮比对四种药食用真菌发酵后醇提液的DPPH自由基清除率的影响Fig.6 Effects of C/N ratio on DPPH· scavenging rate of origin and fermented ethanol extract of four edible fungi

2.3.2 碳氮比对发酵菌质羟自由基清除率的影响 在水提液(图7)碳氮比小于30∶1 (g/g)时,四种真菌发酵后羟自由基清除能力相比于对照组均有提升,说明真菌水提液具有一定的抗氧化能力。高开显[30]研究了灵芝发酵桑枝苦参的功效及成分变化,结果显示苦参经灵芝发酵后,其水提取物清除羟自由基能力显著提高;而碳氮比大于30∶1 (g/g)后,除韩芝外,其它三种真菌发酵后羟自由基清除能力均低于对照组,随碳氮比的增加,基质中燕麦麸皮含量减小,而发酵后菌质自由基清除能力也在减小;可能碳氮比较大时,真菌通过代谢将多糖和多肽转化成了其他物质,从而使得水提液的抗氧化能力减弱。

图7 碳氮比对四种药食用真菌发酵后水提液的羟自由基清除率的影响Fig.7 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented water extracting solution of four edible fungi

对于醇提液(图8),韩芝发酵后羟自由基清除能力随碳氮比的增大而增大,猴头菌则先增大后减小,桑黄先减小后增大,而奥德蘑则呈不断减小趋势。醇提液羟自由基清除结果基本符合黄酮的变化趋势,推测醇提液中对羟自由基有清除能力的活性物质为黄酮[31]。

图8 碳氮比对四种药食用真菌发酵后醇提液的羟自由基清除率的影响Fig.8 Effects of C/N ratio on hydroxyl radical scavenging rate of fermented ethanol extracting solution of four edible fungi

3 讨论与结论

随碳氮比的增加,韩芝、奥德蘑菌丝体生长速度未见显著变化,猴头菌与桑黄菌丝体生长速度明显增长(p<0.05)。发酵后混合菌质活性成分含量明显变化,当碳氮比为20∶1 (g/g)时,桑黄和奥德蘑多糖含量最高达到(132.8±1.16)和(111.22±4.83) mg/g干物质,多肽含量明显增加,桑黄和奥德蘑多肽含量增加了一倍多;黄酮含量也有明显增长。而多酚整体含量下降,在碳氮比为50∶1 (g/g)时,猴头菌、桑黄和奥德蘑的多酚含量在发酵后下降了约1/3。不同的碳源[32]与氮源[33]对不同的菌丝体生长与代谢的影响有明显差异。例如乳糖最适合灵芝菌体的生长、胞内多糖及灵芝酸的合成,而蔗糖则最有利于灵芝胞外多糖的合成[34]。药食用真菌生长发育不同阶段所需碳氮比不同。一般较低的碳浓度有利于菌丝体生长,促进碳源向菌丝体转化,反之则有利于底物转化为产物。Park等[35]发现碳氮比不仅影响许多生物代谢合成速率,对真菌菌丝体生长和胞外聚合物产量也有影响,并通过实验证明较高的碳氮比对菌丝体生长和胞外聚合物生产有益。Babitskaia等[36]也发现当碳氮比为18∶1 (g/g)时,最适宜灵芝胞内多糖的合成,而碳氮比为25∶1 (g/g)时,胞外多糖产量最高。

目前公认通过真菌发酵可以提升发酵底物的抗氧化性,Divate[37]发现乌灵参的抗氧化活性受到发酵底物的显著影响,并且不同的底物可能具有不同的抗氧化机制。高浓度的酚类和类黄酮化合物可能有助于乌灵参的抗氧化活性。Liu等[38]研究通过发酵技术,说明了游离酚和肽的变化对脱脂小麦胚芽总抗氧化性能的协同作用。谢丽源等[39]对23株不同灵芝菌株的主要活性物质多糖、多酚、黄酮、三萜含量进行测定,研究表明四种活性物质含量与各抗氧化测定方法间相关系数低,证明灵芝的抗氧化能力贡献并不完全来自这四类物质。本实验中发酵菌质醇提液对DPPH自由基有较强的清除能力,在碳氮比为40∶1 (g/g)时,韩芝DPPH自由基清除率最高达到96.9%;四种真菌对于羟自由基的清除也有较明显的提升。本文中不同碳氮比的发酵基质下,同一菌种发酵后菌质的抗氧化能力不同;相同碳氮比发酵基质下不同菌种发酵后菌质的抗氧化能力也有明显差异。综合推测,发酵后菌质的抗氧化能力受多方面因素的影响,包括发酵基质、发酵菌种以及发酵条件等。就活性物质而言,虽然发酵后菌质多酚含量明显下降,但其DPPH自由基和羟自由基清除能力明显上升,判断发酵后菌质主要依靠为多糖、多肽以及黄酮等多种物质协同作用达到抗氧化效果。