蓝圆鲹鱼油微胶囊的结构表征与体外消化特性

杨小斌，周爱梅*，王 爽，黄炜超，王 晋

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

蓝圆鲹（Decapterus maruadsi）又称巴浪鱼，其生命周期短、生长速度快，在我国的年渔获量高达60多万t，是我国主要的经济鱼类之一[1]。但蓝圆鲹肉质松软、肉色暗，离水后极易发生腐败及氧化变质，是典型的低值鱼类。目前，将海洋低值鱼加工成鱼油并应用于食品中是低值鱼高值化利用的主要途径之一[2-3]。蓝圆鲹鱼油的主要成分为不饱和脂肪酸，相对含量高达59.57%，且主要为二十碳五烯酸（7.86%）、二十二碳六烯酸（16.76%），具有延缓衰老、降低血脂血压、预防心脑动脉硬化和保护大脑及心脏等生理功能[4]。但鱼油的高度不饱和性使其对氧气、光和热极其敏感，在自由基作用下极易发生氧化酸败，降低其营养价值[5]。因此，选择合适的稳态化技术，有效保护鱼油的生理活性并扩大其应用范围，是开发鱼油产品亟待解决的问题之一[6]。微胶囊技术可将富含多不饱和脂肪酸的鱼油进行微胶囊化，在鱼油周围形成由壁材组成的保护层[7-8]，不仅能有效保护鱼油，减少外界环境（如O2、pH值、水分、温度等）的破坏，防止其见光分解、氧化、挥发[5,9]；而且能增加鱼油的流动性和分散性；此外，鱼油微胶囊的囊壁还能有效地控制鱼油的释放速率，提高其消化吸收率，延长产品货架期[10-11]。微胶囊在其成囊的过程中，物质与物质之间会发生反应[12]，因此，深入探究微胶囊产品的微观结构、光学性质、稳定性、流变性及其在胃、肠道中的消化率和释放性能，也是合理应用微胶囊的前提[6,13]。石燕等[12]利用傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）法和计算机辅助分析法研究壁材乳清蛋白和阿拉伯胶在油脂微胶囊形成过程中的相互作用。牛广财等[14]探讨南瓜籽油微胶囊产品的稳定性与缓释性能，进行了高温加速实验及其在模拟胃液和肠液中的释放性实验。程超等[15]对鸭跖草黄酮类物质的微胶囊化及其微胶囊的释放特性和稳定性进行了研究。刘斯博[16]利用激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）对亚麻籽油微胶囊进行荧光染色观察，更加直观地了解微胶囊的释放行为，从感官评价、热量成分检测、芯材的脂肪酸组成、粒径分布、速溶性等方面考察自制微胶囊的性能。何慧子[17]采取荧光标记示踪法间接测定共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）在动物消化道内的转运情况，证明CLA在大鼠胃中释放极少，但在进入小肠后释放出大部分CLA，表现了较好的缓释性能。

本研究从微胶囊的微观结构与释放性能出发，研究了蓝圆鲹鱼油微胶囊产品的形态结构、其在微胶囊形成过程中与壁材的相互作用及其体外模拟消化特性，对深入探究微胶囊制备条件-膜结构-性能的关系及其在应用环境中的动态行为变化规律具有理论意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝圆鲹鱼油为实验室自制，含有约60%的不饱和脂肪酸；明胶（食品级） 罗塞洛明胶（广东）有限公司；阿拉伯树胶、海藻糖（食品级） 美国唐瑞斯食品物料公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JOYN-8000喷雾干燥机 上海桥跃电子有限公司；LSM700 LSCM 德国Zeiss公司；90plus粒度仪 美国布鲁克海文仪器公司；FJ200-S型数显高速分散仪 上海嫩谷机电设备有限公司；VERTEX 70 FTIR仪 德国BRUKER公司；ZDJ-5型自动电位滴定仪 上海精科仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼油微胶囊的制备

通过前期实验，从乳液乳化稳定性、黏度和微胶囊产率3个方面综合考虑，选取了明胶、阿拉伯胶及海藻糖作为壁材，确定其质量比为3∶5∶2。在水中加入质量分数40%壁材，用磁力搅拌器充分搅拌均匀，随之加入质量分数25%蓝圆鲹鱼油。通过高速分散、高压均质形成均匀的乳液，最后采用喷雾干燥法制备微胶囊化鱼油。

1.3.2 微胶囊包埋率的测定

1.3.2.1 鱼油微胶囊表面油质量分数测定

称取质量为m的鱼油微胶囊产品，用30 mL石油醚轻微振荡条件下准确浸提5 min，过滤。用5 mL石油醚洗涤滤渣，过滤，将滤液全部转移至已恒质量（m1）的圆底烧瓶中，旋转蒸干石油醚，105 ℃烘干至恒质量（m2）[18]。表面鱼油质量分数按公式（1）计算。

1.3.2.2 鱼油微胶囊总油质量分数的测定

用石油醚作为溶剂，准确称取质量为m1的鱼油微胶囊产品，加20 mL热水，使样品充分溶解后，再加入40 mL石油醚-乙醇混合液充分萃取，重复萃取2 次，合并萃取液并全部转移至恒质量（m2）的圆底烧瓶中，萃取液旋转蒸发大部分溶剂后再放入105 ℃烘箱中烘至质量恒定（m3）[19]。总油质量分数按公式（2）计算。

微胶囊包埋率按式（3）计算。

1.3.3 鱼油微胶囊微观结构表征

1.3.3.1 SEM观察

利用扫描电子显微镜（s c a n n i n g e l e c t r o n microscope，SEM）分析鱼油微胶囊产品在形貌上的特点，阐释产品性质和微观结构的关系[20]。在贴有双面胶的样品平台上撒上一定量的鱼油微胶囊产品，用毛细管稍稍压实，使部分粉末陷入双面胶中，用刀片刮去表面粉末后，把多余的微胶囊吹净，随之置于离子溅射仪中在10 mA电流下喷金，使材料表面镀上一层铂膜，然后用SEM观察微胶囊的形态结构。

1.3.3.2 LSCM观察

采用LSCM观察乳液及微胶囊的微观结构[21]。配制质量分数0.02%尼罗红（标记油脂）和0.1%尼罗蓝（标记蛋白）溶解于1,2-丙二醇和水的混合溶液（体积比50∶1）中，混合均匀后于4 ℃下避光保存。观测时，将40 µL混合染料加入1 mL样品中，充分混合均匀后。选择激发波长为488 nm的Ar离子和633 nm的He/Ne离子激光预扫描，采集荧光图像[22]。

1.3.4 鱼油微胶囊囊壁结构形成过程中的相互作用分析

1.3.4.1 FTIR分析

采用KBr压片法，对样品通过FTIR仪进行分析[23]。称取约1 mg样品与100 mg纯KBr充分研磨混匀后放入模具中压片，并以KBr空白压片作参比，于4 000～400 cm－1进行扫描，仪器分辨率为4 cm－1，扫描次数32 次。分别对鱼油、复合壁材、鱼油微胶囊产品进行分析。

1.3.4.2 基于蛋白质二级结构含量变化的FTIR分析

对明胶、复合壁材和鱼油微胶囊产品的FTIR吸收曲线进行二阶求导[23]，根据光谱数据采用Peakfit 4.12软件分析位于1 600～1 700 cm－1波数范围属于酰胺I带特征峰的谱图，先校正基线，然后用Gaussian去卷积，再用二阶导数拟合，进行多次拟合使残差最小，拟合系数大于95%。根据峰面积计算各二级结构含量，各子峰与二级结构的对应关系为：1 615～1 637 cm－1和1682～1700 cm－1处为β-折叠；1 646～664 cm－1处为α-螺旋；1 637～1 645 cm－1处为无规卷曲；1 664～1 681 cm－1处为β-转角[24]。

1.3.5 鱼油微胶囊体外释放特性测定

1.3.5.1 体外消化液的配制

模拟口腔唾液：含有黏蛋白和各种盐分的模拟唾液样品采用Sarkar等[24]的方法制备。模拟胃液：取盐酸23.4 mL，加100 mL水，配制成稀盐酸溶液；然后取16.4 mL稀盐酸溶液加800 mL水及10 g胃蛋白酶，摇匀后加水定容至1 000 mL，调节pH值至2.0。模拟肠液：准确称取3.2 g磷酸二氢钾，加入蒸馏水定容至250 mL，然后用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；称取10 g胰酶，加入适量蒸馏水溶解，将pH 6.8的磷酸二氢钾溶液与胰酶溶液混合均匀，加蒸馏水定容至500 mL，调节pH值至6.8。

1.3.5.2 pH-stat法测定FFA释放率

参考Qiu Chaoying等[25]的方法。取20 mL微胶囊复原液加入20 mL模拟口腔唾液，使最终混合物含有质量分数3%鱼油，整个体系的pH值为6.80。混合均匀后于200 r/min的摇床中（37±1）℃保温10 min。然后取20 mL模拟口腔唾液消化后的产物与模拟胃液按体积比1∶1混合，混合反应液用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至2.5后于200 r/min的摇床中（37±1）℃保温2 h。取30 mL模拟胃液消化产物加入干净烧杯中，用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0，混合液加入含有3.5 mL 187.5 mg/mL胆汁盐、1.5 mL CaCl2和NaCl溶液的模拟小肠液。混合后调节pH值至7.0，迅速加入2.5 mL脂肪酶开始反应，在消化过程中用pH计检测pH值的变化，并用0.05 mol/L NaOH溶液滴定使其保持在pH 7.0，记录所消耗的NaOH溶液体积。采用不加鱼油的空载乳液作与上述相同的消化过程，测定NaOH溶液消耗量并从相应样品中扣除，根据消化过程中消耗的NaOH溶液体积，按公式（4）计算样品的游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）释放率。

式中：V（NaOH）为滴定所用NaOH溶液体积/L；c（NaOH）为NaOH的浓度/（mol/L）；M鱼油为鱼油的平均摩尔质量/（g/mol）；m鱼油为油相的质量/g。

1.4 数据统计分析

实验中所有数据均为至少两次测定的平均值，并计算标准偏差，利用Origin 8.5软件作图，利用SPSS 7.0软件Duncan’s multiple range test进行多组样本间差异显著性分析并进行多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 鱼油微胶囊的结构特性表征结果

2.1.1 SEM观察结果

图1 SEM观察鱼油微胶囊形态结构Fig.1 Morphological structure of fi sh oil microcapsules observed by scanning electron microscope

微胶囊颗粒的结构状态与微胶囊的流动性、保护芯材的能力密切相关。从图1可以看出，所制备的蓝圆鲹鱼油微胶囊颗粒外形较圆整，基本接近球形，大部分颗粒表面光滑、致密、无裂痕，整个表面是连续的。

2.1.2 LSCM观察结果

图2 LSCM观察鱼油微胶囊形态结构Fig.2 Morphological structure of fi sh oil microcapsules observed by LSCM

LSCM是用于分析多组分聚合物共混体系形态结构最常用的方法。图中绿色荧光为鱼油部分，红色荧光为蛋白质部分。从图2a中可以看出，采用复合壁材包埋鱼油形成的乳液，蛋白与多糖复合壁材已经将鱼油完全包裹，形成了较为紧密、连续的球形囊壳结构，且为单核结构，与SEM观察结果一致。从图2b中可以看出，喷雾干燥后鱼油微胶囊壁材集中区域荧光强度较为均匀，说明蛋白类壁材已均匀地分布于微胶囊的囊壁上，而标记油脂的绿色荧光很弱，几乎没有观测到，说明壁材已经将鱼油包埋起来。整体上看，微胶囊未出现大范围聚集，包埋效果良好。

2.2 鱼油微胶囊结构形成过程中的相互作用

由图3中可以看出，明胶FTIR图谱中3 435 cm－1处为O—H的伸缩振动吸收峰，1 634 cm－1处为C＝O或反对称羧基伸缩振动，1 400 cm－1处为C—H弯曲振动。在复合壁材红外光谱中3 387 cm－1处强而宽的吸收峰为复合壁材分子上O—H及N—H的伸缩振动吸收峰，2 940 cm－1处为—CH2对称伸缩振动吸收峰，1 648 cm－1处的吸收峰是酰胺I带中C＝O的伸缩振动吸收峰，1 090 cm－1处的吸收峰属于壁材中多糖的C—O伸缩振动与环的振动。在蓝圆鲹鱼油红外光谱中，3 012 cm－1处为脂肪酸双酯双键顺式结构中的顺式碳碳双键C＝C—H的伸缩振动，说明鱼油富含不饱和脂肪酸；2 928 cm－1和2 852 cm－1处为—CH2中C—H键反对称伸缩振动和对称伸缩振动；1 745 cm－1处为脂肪酸酯键中C＝O的特征吸收峰。当壁材与芯材混合并经过喷雾干燥后，鱼油微胶囊的FTIR图谱既有壁材的特征吸收峰，又有鱼油的特征吸收峰，并且在3 398 cm－1处出现强而宽的吸收峰，说明新物质共价交联反应出现了新的N—H键，导致吸收峰强度增大[26]。鱼油在3 012 cm－1及1 465 cm－1处的特征吸收峰经过微胶囊化后在鱼油微胶囊FTIR图谱中变得很弱，说明蓝圆鲹鱼油可能被3 种混合壁材包埋在内部，因此未出现强振动峰，由此可初步确定蓝圆鲹鱼油微胶囊的形成[27]。

图3 FTIR表征鱼油微胶囊结构形成过程的变化Fig.3 Changes of structure formation of fi sh oil microcapsule characterized by FTIR

为了进一步分析微胶囊化过程中含蛋白质的复合壁材形成过程结构的变化情况，利用去卷积方法对酰胺I带（1 600～1 700 cm－1）进行拟合。结果表明，明胶的拟合系数R2＝0.994 61，复合壁材的拟合系数R2＝0.999 48，鱼油微胶囊的拟合系数R2＝0.999 18，如图4所示。

图4 酰胺I带的FTIR曲线和高斯曲线拟合图谱Fig.4 FTIR curves and Gauss curve fi tting of amide I band

表1 酰胺I带曲线拟合结果及谱图指认Table1 Fitting results of amide I band curve and identif i cation of secondary structures

由图4和表1可知，明胶、复合壁材及微胶囊化鱼油产品中均包含β-折叠、α-螺旋、无规卷曲和β-转角4 种结构。与纯明胶相比，明胶经过与其他壁材复配形成复合壁材后，β-折叠含量增加了4.78%（P＜0.05），α-螺旋含量减少了1.94%（P＞0.05），无规卷曲含量减少了2.15%（P＜0.05），β-转角含量减少了0.09%（P＞0.05）。明胶经过与其他壁材复合，并加入鱼油制成鱼油微胶囊后，β-折叠含量增加了2.68%（P＜0.05）；α-螺旋含量减少了1.33%（P＞0.05）；无规卷曲含量减少了2.80%（P＜0.05）；β-转角含量增加了2.63%（P＜0.05）。同时，与未添加鱼油的复合壁材相比，添加鱼油后，α-螺旋含量增加0.61%，β-折叠含量下降了2.10%、无规卷曲含量减少了0.65%、β-转角含量增加了2.72%，说明蛋白界面膜的弹性及延展性得到提升。分析其原因可能是鱼油中含有较多极性基团或烯烃，疏水环境对于氢键的形成没有影响，可能促进α-螺旋结构的形成，减少分子间氢键形成，从而有利于改善蛋白界面膜的弹性及延展性[28]。α-螺旋和β-折叠属于相对规则的构象，多数存在于蛋白质的内部，这两种结构中分布着较多的氢键，能与其他基团发生氢键键合，使得蛋白质的二级结构趋于规则，从而具有一定的刚性；β-转角和无规卷曲中不存在氢键或其他相互作用，使分子表现出较大的柔性；明胶与阿拉伯胶、海藻糖经过混合、溶解、均质乳化、喷雾干燥后，其刚性结构含量从65.66%分别增加到68.50%、67.41%，柔性结构含量从34.34%分别减少到31.50%、32.59%，说明壁材复配及鱼油微胶囊化后蛋白质的二级结构趋于规则，刚性增加，有利于提高囊壁稳定性。同时，研究中发现，纯明胶蛋白质在微胶囊形成并经过喷雾干燥后，酰胺I带向低波数方向移动，说明明胶蛋白质分子与海藻糖和阿拉伯胶的羟基发生了氢键缔合作用，减轻了蛋白质受热脱水作用导致的界面膜或囊壁结构不均匀收缩，有利于维持微胶囊结构的稳定性[29-30]。

2.3 鱼油微胶囊体外模拟消化特性分析

图5 模拟消化过程中FFA释放率随时间的变化Fig.5 Release rate of free fatty acids during simulated digestion

图5 为微胶囊化鱼油在模拟体外口腔唾液消化10 min、胃液消化120 min后，在肠液中消化产物FFA的释放曲线。开始时微胶囊产品FFA释放率增加幅度较大，这可能是微胶囊表面残留的表面油被消化所导致的；而在随后相当长的一段时间内，鱼油微胶囊的FFA释放率增速放缓。在肠液中模拟消化120 min后，鱼油的FFA释放率最高仅达到72.62%，说明鱼油微胶囊未能完全溶解释放。究其原因可能是糖类和蛋白质类物质交联作用组成的壁材具有较致密的结构，模拟口腔消化液及胃液对微胶囊囊壁的消化能力有限，而胃液只能初步消化糖类物质，对蛋白质类物质的消化能力有限，无法完全破坏微胶囊壁材[23]。因此，复合壁材具有较强的抗消化能力，能有效保护鱼油直至在肠液中释放。

LSCM可实现对特定物质的定性及定量观察，对指定物质进行荧光染色，经过不同激发态激光光源的扫描，有利于更加清晰地观察微胶囊在模拟体外消化实验中的释放行为及形态变化过程。图6为LSCM反映的鱼油微胶囊在模拟消化过程中微胶囊形态的变化。

图6 模拟消化过程中鱼油微胶囊形态变化Fig.6 Morphological changes of microcapsules during simulated digestion

如图6所示，模拟消化前，鱼油微胶囊呈完整包埋状态，表面有少量的绿色荧光。在经过唾液消化后，鱼油微胶囊发生一定的溶胀效应，体积增大，但由于鱼油微胶囊在唾液环境中消化的时间较短，其保持了比较完整的形态，说明其在口腔唾液中稳定。经过2 h的模拟胃液消化，鱼油微胶囊形态发生明显变化，部分颗粒发生溶胀，油脂外溢在微胶囊壁材的表面。其原因可能是在蛋白酶的作用下微胶囊含有的蛋白成分发生水解，经初步消化，微胶囊出现部分分解，释放出鱼油[26]。图6d表明，经过模拟肠液消化后，鱼油微胶囊的粒径明显减小，且显微镜下微胶囊分布量明显减少、颗粒变小，说明可能是鱼油微胶囊发生分解，造成了微胶囊蛋白质骨架结构的深度降解。模拟消化实验结果表明，微胶囊壁材虽然在模拟胃液、肠液环境的作用下不断溶解，但囊壁仍然能保持完整的厚度均匀的结构，阻止芯材立即释放，起到缓释作用[13]；当微胶囊进入模拟肠液中时，碱性环境使其平均粒径逐渐减小，加速壁材结构的瓦解[13]。随着微胶囊颜色的改变，可以看出壁材保护结构在逐渐瓦解，鱼油由中心向壁材表面迁移扩散，鱼油逐步释放。

3 结 论

本实验制备的微胶囊化蓝圆鲹鱼油产品颗粒圆整、表面光滑，为单核的腔体结构；通过荧光标记油脂和蛋白，更加清晰地显示了壁材包裹芯材结构的形成。对芯材、复合壁材FTIR图谱进行分析，发现谱图中同时出现囊芯和囊壁的特征吸收峰，证明了鱼油被包裹在囊壁中。喷雾干燥后蛋白质的二级结构趋于规则，刚性增强，β-转角和无规卷曲中存在氢键作用，柔性增强，有效地抑制了鱼油在干燥成囊及贮存中的扩散逃离，有利于微胶囊结构的稳定，对鱼油的延缓释放起到重要作用。体外模拟消化结果表明微胶囊化能够有效抵抗口腔唾液、胃液环境对鱼油的消化，提高鱼油在肠液中的缓释能力。用LSCM可观察到模拟消化过程中微胶囊标记物颜色的改变，鱼油由中心向壁材表面迁移，鱼油逐步释放。从微观结构对囊壁形成过程的相互作用及模拟消化特性进行系统分析，对于检验微胶囊包埋效果、产品稳定性及生物利用度具有一定意义。