外泌体介导阿尔茨海默病发病机制的相关研究进展

杨琪洁 廖鑫鑫 肖婷婷 沈璐

1 背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最为常见的变性病 性痴呆类型，占所有痴呆病例的60%至80%。它的临床特征是起病隐匿，进行性恶化，以认知功能受损为核心，伴随精神行为症状且逐渐出现日常生活能力的受损。AD 病理学 特征是神经元外老年斑（amyloid plaques）沉积、神经元内神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）及神经元变性坏死。

关于AD 发病机制尚不清楚，主要有根据β-淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）异常聚集提出的Aβ 假说和根据NFTs 病理特点提出的Tau 假说。随着AD 的疾病进展，人们可以观察到老年斑和NFTs 在皮质中按照相对固定的模式扩散，由此有人提出AD “朊蛋白样机制”，即病理性的蛋白质可以在细胞-细胞之间传播，从而导致疾病的扩散。据报道，外泌体在神经退行性疾病（如AD，帕金森病和朊病毒疾病）的病理性蛋白传播中发挥作用。在这篇综述中，我们将讨论外泌体在APP 和tau 蛋白的代谢和分泌中的作用以及对AD 发病机制的影响。

2 外泌体的形成与组成

外泌体是一种直径50～100 nm的膜性囊泡，机体的大多数细胞都可分泌。外泌体的形成过程大致为：首先，从早期内体到晚期内体成熟的过程中，内体膜向内凹陷发芽并断裂形成多个包绕细胞内成分的腔内囊泡（Intraluminal vesicles，ILVs），在这个过程中诸如蛋白质、脂质和RNA 等分子被包裹到泡腔之中，这导致晚期内体呈现多泡状外观，因此根据它的形态特征，晚期内体又称为多泡体（multivesicular bodies，MVBs）。MVBs 有两种不同的命运，一部分MVBs 通过与溶酶体融合，将其内容物进行降解；而另一部分 MVBs 则与细胞膜融合，将其内在的ILVs 分泌出细胞，ILVs 最终形成外泌体。

外泌体主要由两种类型分子组成：结构分子和货物分子。无论外泌体来源于何种细胞类型，其结构分子是特有的，并且对维持外泌体的基本结构和功能具有重要作用。外泌体通过内体通路释放，所以外泌体中都包含Tetraspanins 蛋白（CD9，CD63，CD81 和CD82），Rab GTPases，flotillin，Alix，TSG101和热休克蛋白（Hsc70，Hsp90）等蛋白质。货物分子，即通过外泌体运输的脂质、蛋白质和遗传物质等。不同细胞来源的外泌体携带不同的蛋白质。例如，主要组织相容性复合物II 类（MHCII）主要源自抗原呈递细胞的外泌体中。细胞还可以在不同的病理和生理条件下通过外泌体释放朊病毒，β-淀粉样蛋白肽，tau 蛋白，错误折叠的超氧化物歧化酶-1（SOD1）和α-突触核蛋白。外泌体中脂质成分的主要作用是调节小RNA 和蛋白质的外泌体分选。除蛋白质和脂肪外，外泌体还负责遗传物质的运输，如DNA，mRNA，miRNA，核糖体RNA（rRNA），环状RNA 和长非编码RNA（lnRNA）等。其中，miRNA（＜30 个核苷酸）占所有外泌体RNA 的50%以上。然而，也有研究认为核糖体 RNA（rRNA），特别是28S 和18S rRNA亚基是外泌体中主要RNA。这可能是由于外泌体提取纯度和细胞来源的不同导致的。

3 外泌体在中枢神经系统中的作用

外泌体具有调节神经元发育、再生和突触功能的作用，更使人感兴趣的是，外泌体可以介导神经变性疾病相关的错误折叠蛋白在细胞-细胞之间的传递。细胞释放外泌体，一方面可以将细胞内多余的物质排出，另一方作为信使介导细胞间的交流。外泌体既可在邻近细胞间传播，也可以随体液分布作用于远隔组织。外泌体介导信号传递有以下途径：（1）通过与靶细胞质膜融合，直接注入其内物质于靶细胞之中。（2）利用靶细胞的内吞或吞噬作用，直接将外泌体摄入细胞内。（3）外泌体与靶细胞上的受体结合，从而进行信息传递。在CNS 中，大多数细胞均能释放外泌体，例如神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞和小胶质细胞。外泌体介导的细胞通讯具有高效性、细胞特异性和细胞选择性。外泌体介导AD 发病机制的相关研究将在后文重点论述。

4 外泌体与Aβ

Aβ 由淀粉样前体蛋白（amyloid β precursor protein，APP）水解产生，长度从36 到43 个氨基酸不等。APP有两种切割方式，即淀粉样和非淀粉样水解。前者APP 首先经β-分泌酶（BACE-1）水解，生成大的可溶性胞外片段（sAPP-β）和膜结合C末端片段（β-CTF），后者再被γ-分泌酶水解生成APP 胞内结构域（APP intracellular fragment，AICD）和Aβ；Aβ 主要被释放到胞外，聚集成寡聚体（Oligomer）和纤丝体（Fibrils）。寡聚体被认为是最具毒性的Aβ 形式，纤丝体则是老年斑的主要成分。在非淀粉样蛋白生成途径中，α-分泌酶则在Aβ 结构域的第16 和17 位氨基酸之间将APP 蛋白水解为sAPPα 和α-CTF 两部分，α-CTF 进一步被γ-分泌酶水解，生成AICD 和可溶性的p3，从而减少Aβ 的产生。BACE-1 是Aβ 生成的关键酶，它主要在高尔基网络和内体这些酸性细胞器中发挥水解酶功能。APP 的淀粉样蛋白生成途径也主要发生在早期内体。既然如此，那sAPP-β，APP，BACE-1 和Aβ 是否也存在于内体来源的外泌体中呢？近年来，科学家们进行了这方面的探索，不仅证实Aβ 可以通过外泌体运输，而且在外泌体中也发现了APP 切割的关键成分（BACE、PS1、PS2 和ADAM10），提示外泌体可能是APP 水解的另一场所。

然而，外泌体在AD 疾病进展中的作用仍存在争议。一部分学者认为外泌体可能推动AD 进展。最近的研究结果表明Aβ 的毒性寡聚体（Aβ oligomers，oAβ）可能以类似朊病毒的方式引起病理学传播，尽管其基本机制尚不完全清楚。Maitrayee Sinha 等的研究显示AD 患者大脑外泌体oAβ 水平增高；体外实验中，oAβ 寡聚体可通过外泌体在神经元与神经元之间传播；通过阻断外泌体的形成、分泌或摄取会降低Aβ 寡聚体的扩散和相关的毒性。Yuyama等发现在散发性AD 患者的脑中观察到神经元中的内吞途径损伤，包括早期内体的增大和Rab5 的上调。这种损伤使含有GM1 神经节苷脂的外泌体的释放，并诱导了淀粉样蛋白原纤维的形成。Wang 等发现，Aβ可诱导富含PAR-4 和C18 神经酰胺的外泌体的分泌，后者进一步引起细胞凋亡。相反，也有部分研究认为外泌体具有神经保护功能，N2a分泌的外泌体能阻止Aβ 单体聚集成寡聚体、减少Aβ 诱导的原代神经元细胞凋亡、增加小胶质细胞清除的Aβ 能力以及在溶酶体降解过程。细胞朊蛋白[PrP（C）]，作为一种在外泌体上高度表达的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定表面糖蛋白，通过其N-末端与低聚Aβ 紧密结合，加速淀粉样蛋白β 的纤维化，从而减少低聚Aβ 神经毒性作用。简言之，外泌体可能在Aβ 代谢通路中起到双刃剑的作用。

5 外泌体与Tau

NFTs 由神经元内过度磷酸化的tau 蛋白聚集形成。在AD 中，tau蛋白病理过程遵从Braak 分级学说，最先出现在内嗅皮质及其周边区域（Braak 阶段I-II），随后出现在海马和杏仁核，累及皮质联合区（Braak阶段III-IV），最终侵犯新皮质区域（Braak 阶段V 和IV）。人类大脑中病理性tau 蛋白扩散机制一直是研究的热点。有越来越多的证据表明病理性tau 蛋白类似“种子”，以“类朊病毒样机制”扩散和复制，受体细胞摄取这些“种子”导致自体内单体tau 的错误折叠继而聚集。大脑中病理性tau 蛋白扩散的前提是这些类似“种子”的tau 蛋白能在神经元细胞之间传播。Tau 蛋白自身并没有分泌信号肽，外泌体介导的分泌途径可能在这一进程中发挥重要作用。Wang 等发现含有tau 蛋白的外泌体可通过轴突运输至突触前膜，并释放至突触间隙，然后通过突触连接被下一级神经元突触后膜内化吸收。如此传递，导致tau 蛋白在神经元中传播。Sudad Saman 等在M1C 神经母细胞瘤tau 蛋白病模型中发现，tau 蛋白能以外泌体形式分泌出，其中包含有早期AD 标志物（AT270）。在人脑脊液样本中发现tau 蛋白相关的外泌体。AD 患者血浆神经来源外泌体中磷酸化Tau 蛋白的水平显著高于正常对照。有关证据表明，只有tau 蛋白病理性聚集的细胞才能分泌具有种子活性 tau蛋白的外泌体，其中磷酸化tau 及寡聚体tau 被认为是具有种子活性。Polanco 及其同事利用rTg4510 小鼠 证明，只有作为“种子”的tau 蛋白在细胞内到达一定浓度时才能使细胞内tau 蛋白聚集，即阈值依赖的形式。由于外泌体中仅含有少量的“种子”tau 蛋白，当其缓慢积累到活性阈值时，才能引起细胞内tau 蛋白聚集，这可能可以解释AD 进展缓慢。

6 外泌体与 AD 的诊断与治疗

通过分离神经元来源的外泌体（Neuron-derived exosomes，NDEs），研究者发现其内多种蛋白质可作为AD 的潜在生物标志物，其大致可分为3 类。① Aβ 病理相关蛋白，如Aβ、BACE-1、突触蛋白等，这些提示突触变性。② 葡萄糖代谢相关蛋白，如Akt 信号通路、MAPK 信号通路、mTOR 信号通路。③ Tau 病理相关蛋白，如总tau、p181-Tau、P396-Tau、轻链蛋白（NF-1）、溶酶体蛋白等。此外，外泌体内发现多种miRNA 也是AD 的潜在生物标志物，多个研究表明在AD 患者脑组织及脑脊液来源的外泌体中，NF-κB诱导型miRNA 家族表达上调，如miRNA-9， miRNA-34a，miRNA- 125b，miRNA-146a 和miRNA-155等，这些miRNAs 进一步调控下游先天免疫和炎症信号，影响线粒体能量代谢等。

通过对这些标志物及其通路的深入研究，可进一步发现AD 治疗的新靶点，如可通过改变各种激酶和蛋白酶的活性、调控兴奋性突触蛋白的水平及细胞因子等方式来治疗AD。另一方面神经退行性疾病（如AD）的发生多与大脑内微环境改变有关，可以通过外泌体介导的细胞间信息交流调节大脑微环境进而调整AD 疾病的进展。有研究表明间充质干细胞（MSC）来源的外泌体有希望成为是AD 治疗的新工具，其包含的生物活性分子有抑制炎症反应、调节免疫系统及清除Aβ及oAβ 的功能，从而重塑突触功能、阻止神经细胞死亡及减慢AD 患者记忆力下降。外泌体可以在CNS 和外围循环之间交换，通过血脑屏障，经修饰的外泌体可以形成向特定神经元输送的独特药物系统。

7 结语

综上所述，外泌体一方面能促进Aβ、tau 蛋白的聚集、扩散，从而造成神经元死亡，促进AD 的进展，另一方面，外泌体又具有一定程度的神经保护作用。此外，外泌体独有的生物学特点使其成为AD 诊断与治疗的新靶点。因此，进一步探索外泌体与AD 之间的联系具有重要意义。◎