凋亡抑制蛋白抑制剂临床研究进展

韩开林 高倩倩 刘文丽 王国成,

细胞凋亡或程序性死亡是一种天然的细胞周期过程，旨在消除体内不需要的或受损的细胞。在健康组织中，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间存在良好的调节平衡，通过这些蛋白的共同作用来控制细胞凋亡过程的发生。研究发现，细胞凋亡机制的缺陷与凋亡抑制蛋白的表达密切相关。细胞凋亡的逃避是癌症的标志之一，并且可以通过抗凋亡蛋白的过表达来实现，在各种癌症中可观察到通过扩增、过表达和内源性拮抗剂的丧失所导致的IAP 的失调，并伴随肿瘤生长、预后不良和耐药性方面的问题。激活促凋亡过程的关键是依赖于受IAP 家族调控的一类半胱氨酸蛋白酶（Caspase 激酶）的活化。凋亡抑制蛋白是细胞凋亡的关键调节因子，使其成为抗肿瘤治疗的热门靶点[1-2]。此外，cIAP1 作为IAPs 家族中重要的一员，已证实能显著增强宫颈癌细胞对顺铂的敏感性，进一步揭示IAP 抑制剂在肿瘤联合 治疗中的作用[3]。

1 凋亡抑制蛋白

1993年在杆状病毒中发现了第一种细胞凋亡抑制蛋白（IAPs），来抑制病毒诱导的细胞死亡[4]。此后不久，在人类、小鼠和昆虫中发现了几种细胞凋亡抑制蛋白的同源物，进一步证明了细胞凋亡抑制蛋白（IAPs）抑制了细胞的凋亡，并且其与正常细胞功能和疾病进展息息相关[5]。迄今为止，已发现8个人类该蛋白家族成员（NAIP,c-IAP1,c-IAP2,XIAP,Survivin,Bruce,ILP-2 和Livin）。

1.1 凋亡抑制蛋白作用机制

X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）可通过直接结合半胱天冬酶（Caspase 激酶）来预防细胞凋亡。在结构上，包含三个杆状病毒IAP 重复序列（BIR）结构域和C 末端的RING（really interesting new gene）的 锌指结构，现已证实第三个BIR 结构域（BIR3）有效地结合并抑制Caspase-9 的活性，而第二个BIR 结构域（BIR2），可有效抑制Caspase-3 和Caspase-7。研究发现除XIAP 外，cIAP1 和 cIAP2 与肿瘤坏死因子相互作用，拮抗了Caspase-8 的活化，进而抑制了TNF 受体介导的细胞凋亡[6-9]。

1.2 Smac 蛋白抑制剂

细胞凋亡是一种严格调控过程，且在正常细胞中已鉴定出天然IAP 抑制剂，即第二个线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂（Smac）。Smac 是一种线粒体结合蛋白，当促凋亡信号释放到细胞质中后，有效地与cIAP1、cIAP2 和XIAP 结合，来达到细胞凋亡的目的[10-11]。在外界环境的刺激下，Smac 蛋白会从线粒体中释放出来，其暴露出的N-末端四肽序列Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）能够与XIAP、cIAP1 和cIAP2相互作用。其中，二聚体Smac 蛋白可与XIAP 的BIR2 和BIR3 结构域结合，能够拮抗XIAP 与Caspase-9 和Caspase-3/7 的结合[12-13]。在cIAP1 和cIAP2 中，Smac AVPI N-末端四肽序列仅与其BIR3结构域紧密结合。

在这些前提下，模拟Smac AVPI 四肽的药物作为潜在的新型治疗剂来恢复在肿瘤中被XIAP 和（或）cIAP1/2 表达所抑制的细胞凋亡。迄今为止报道的大多数Smac 模拟物都是泛IAP 抑制剂，这意味着其均能够有效抑制XIAP，cIAP1 和cIAP2的活性，但仅有少数化合物可选择性作用于cIAP1或cIAP1/2[14-15]。

2 凋亡抑制蛋白抑制剂

凋亡抑制蛋白（IAPs）是细胞凋亡和促存活信号通路的重要调节因子，其失调通常与炎症、肿瘤发生及生长有关[16]。以IAP 为靶点的抗肿瘤和抗乙型肝炎药物已成为当今研发的热点，且有多种IAP抑制剂已进入临床试验阶段。

2.1 IAP 抑制剂作为抗肿瘤药物的研究进展

目前，IAPs 抑制剂的研究类型为Smac 模拟物和非肽类小分子两类，而Smac 模拟物可依据结合位点的数目分为单体和二聚体抑制剂。LCL-161、AT-406、GDC-0152、GDC-0917 是进入临床阶段研究的单体抑制剂，能与XIAP、cIAP1、cIAP2 相结合，激活 Caspase-9 活性，达到细胞凋亡的目的；AEG-40826、Birinapant、APG-1387 是进入临床阶段的二聚体抑制剂，通过激活Caspase-3/7/9 的活性，来达到促进细胞凋亡的目的；ASTX-660、UC-112、DH-XP-0090 为研究较多的非肽类小分子。

2.1.1 LCL161 LCL161 是由诺华研发的小分子IAP 抑制剂，在实体瘤中具有较好的抗肿瘤活性（如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌和肝癌等）。LCL161 在癌细胞中具有显著的促凋亡和抗增殖作用[17]。在肝细胞癌（HCC）中，LCL161 对肿瘤治疗的效果取决于Bcl-2 的表达，Bcl-2 表达水平低的HCC 细胞系对LCL161 敏感，Bcl-2 表达水平高的细胞对LCL161治疗具有抗性[18]。

在实体瘤中LCL161 可以增强紫杉醇的抗肿瘤作用，包括三阴性乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和肺癌[19]。LCL161 与紫杉醇联用针对晚期胰腺癌、乳腺癌等实体肿瘤的患者完成了Ⅰ期临床实验。在三阴性乳腺癌（TNBC）患者（NCT01617668）的LCL161联合紫杉醇的Ⅱ期临床试验中，将TNBC 患者依据基因表达标记分类为（GS+/GS-）并被随机分为紫杉醇，80 mg/（m2·周），Ⅳ；单药组和紫杉醇，80 mg/（m2·周），Ⅳ+LCL161（1 800 mg/周,口服）联合组，主要目的是评估LCL161 是否增强紫杉醇对TNBC 患者的疗效（pCR 率增加7.5%）。研究结果显示，在GS+组中，LCL161 在抗肿瘤方面具有增效作用，其中联合组和单药组的患者均达到pCR；在GS-组中，没有明确的数据能够证明LCL161 抗肿瘤的增效作用，其中联合组未达到pCR，单药组达到pCR。最新研究显示，单独的LCL161 与LCL161 联合紫杉醇对HCC 显示出不同的作用，LCL161 联合紫杉醇不会增强促细胞凋亡作用，但会增强HCC 细胞的抗增殖作用[20]。

2.1.2 ASTX-660 ASTX660 是由Astex Therapeutics公司通过基于药物的片段设计发现的有效、非拟肽的cIAP1/2 和XIAP 拮抗剂。ASTX660 对XIAP 和cIAP1 的拮抗作用在纯化的蛋白质、细胞和体内异种移植瘤模型中得到证实。该化合物与具有纳摩尔效力的XIAP 和cIAP1 的分离的BIR3 结构域结合。在细胞和异种移植组织中，通过测量其从胱天蛋白酶-9或Smac 的置换来证明XIAP 的直接拮抗作用。化合物诱导的cIAP1/2 的蛋白酶降解，导致NIK 稳定的下游效应和非经典NF-κB 信号传导的激活，证明了cIAP1/2 拮抗作用。用ASTX-660 处理能够诱导体外各种癌细胞系中TNF-α 依赖性的细胞凋亡，在小鼠乳腺和黑素瘤肿瘤异种移植瘤模型中可有效抑制肿瘤生长[21]。临床前研究结果显示，在小鼠MDA- MB-231 异种移植模型中，单次口服剂量20 mg/kg时，针对cIAP1 和XIAP 的拮抗作用长达72 h，在给药后6 h 和24 h 能够诱导凋亡标志物表现出对XIAP（HEK293-XIAP-Caspase-9）和cIAP-1（MDA-MB- 231）较强的抑制作用。对猴子hERG 评价显示，QT间期没有影响的最大耐受剂量为100 mg/kg[22]。ASTX660 目前正在进行晚期实体瘤和淋巴瘤的Ⅰ/Ⅱ期试验（NCT02503423）。

2.1.3 AT-406 AT-406（Debio-1143）是由密歇根大学研制的靶向IAP 抑制剂，其针对cIAP1、cIAP2和XIAP 蛋白结合的IC50 值分别为12.3、22.1 和225 nmol/L。AT-406 是第一个注册用于治疗晚期癌症的Smac 拟态物[23]。Debio-1143 在人卵巢癌治疗中有较强的增敏作用，并对铂类药物固有或获得性耐药性的患者具有治疗潜力[24]。体内研究表明，AT-406 在异种移植瘤中诱导细胞凋亡方面效果显著，其在小鼠MDA-MB-231 移植瘤模型中口服给予100 mg/（kg·d），持续14 d，结果显示该药物可有效抑制肿瘤的生长，且未发现小鼠体重明显下降[10]。2013年6月开始针对AT-406 联合卡铂、紫杉醇治疗鳞状非小细胞肺癌、卵巢癌、三阴性乳腺癌的Ⅰ期临床试验（NCT01078649），患者接受AT-406（100～200 mg/m2）口服剂量递增治疗，21 d 为1 个疗程。结果显示，口服剂量达到每天175 mg/m2时仍未观测到剂量限制性毒性（DLTs），目前正处于Ⅱ期临床的研究阶段。此外，AT-406 联合道诺酶素、阿糖胞苷用于治疗急性骨髓性白血病及单一组分用于治疗实体瘤正处于Ⅰ期临床阶段[25]。

2.1.4 GDC-0152 GDC-0512 是由Genentech 公司开发的Smac 拟态物，GDC-0152 结合XIAP-BIR3、cIAP1-BIR3、cIAP2-BIR3 的结合常数Ki 值分别为28、17、43 nmol/L。GDC-0152 能够诱导核因子-kB转录活性，导致几种趋化因子和细胞因子的表达，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）[26]。通过对狗和大鼠的体内研究，每周口服给药1 次，给药剂量10 mg/kg，结果显示血浆中的细胞因子和趋化因子升高，急性期蛋白诱导的炎性白细胞和肝转氨酶增加，肿瘤显著缩小，且受试动物对药物耐受性良好。GDC-0152 在转移性实体肿瘤或非霍奇金淋巴瘤性白血病患者的I 期临床试验中（3+3 设计），给予0.049，0.1，0.2，0.28，0.39，0.54，0.76，1.06 或1.48 mg/（kg·d）的1 个剂量，持续给药2 周，结果显示该药在人体中的平均血浆清除率为（9±3）ml/（min·kg），分布容积为（0.6±0.2）L/kg，进一步表明GDC-0152 的药物浓度与剂量呈线性关系[27]。

2.1.5 GDC-0917 GDC-0917 是由Genentech 公司开发的第二代泛 IAP 抑制剂，GDC-0917 结合XIAP-BIR3、cIAP1-BIR3、cIAP2-BIR3 的结合常数Ki＜60 nmol/L，在小鼠MDA-MB-231 异种移植瘤模型中以剂型依赖性方式抑制肿瘤生长。GDC-0917 在实体肿瘤和淋巴瘤42 例患者的Ⅰ期临床研究试验中，每天口服给药剂量5～600 mg，3 周为一个疗程。结果显示，约20%患者出现疲劳、恶心、呕吐和便秘等不良反应，但未达到最大耐受剂量（MTD）。GDC-0917 药代动力学显示剂量与抑制浓度成正比，最大剂量可达到临床前建模预测的抑制浓度。在所有剂量水平下，外周血单核细胞（PBMC）中cIAP1的表达迅速降低，其中3 例患者的连续组织活检结果显示肿瘤中cIAP1 表达降低及Caspase-3 和PARP活性降低，2 例患者病情得到缓解，4 例患者病情稳定超过3 个月[28]。

2.1.6 AEG-40826 AEG-40826（HGS1029）是由Aegera Therapeutics 和 Human Genome Sciences 共同开发的一种二聚体小分子IAP 抑制剂，可作为单一药物或联合药物直接杀死肿瘤细胞。在一项关于HGS1029 的安全性，药代动力学/药效学（PK/PD）的临床试验中，共有44 例患有晚期实体瘤的患者（女20 例，男24 例，平均年龄62 岁，年龄41～88 岁），将A 组（每28 天的第1 天，第8 天和第15 天）和B组（连续每周）共分为10 个组（Sch A：0.1，0.2，0.4，0.6，0.9，1.4，2.1，3.2 mg/m2；Sch B：3.2 和4.8 mg/m2）静脉注射15 min 进行评估；DLTs 的剂量在1.4 mg/m2时观察到有1/9 患者淀粉酶、脂肪酶升高和出现疲劳，剂量为4.8 mg/m2时观察到1/3 患者疲劳、无症状的淀粉酶和脂肪酶升高）。据报道，常见的不良反应可能与HGS1029 有关，包括恶心（33%）、厌食症（21%）、发热（21%）、呕吐（19%）、腹泻（17%）、疲劳（17%）和皮疹（12%）。4 例患者出现1～3 级严重的面神经麻痹；所有4 例患者均接受3.2 mg/m2HGS-1029，但4 例患者中只有3 例康复，23 例患者有短暂的淋巴细胞减少症。已经证实经HGS1029 治疗的结肠癌和2 例（非小细胞肺癌、肾上腺皮质癌）癌症患者均出现肿瘤消退，且疾病稳定期均超过6 个月。HGS1029 在患有晚期实体恶性肿瘤的患者中具有良好的耐受性[29]。

2.1.7 Birinapant Birinapant（TL32711）是一类二聚体IAP 抑制剂，Birinapant 与XIAP、cIAP1 和cIAP2结合的解离常数（Kd）分别为45 nmol/L、＜1 nmol/L和36 nmol/L。Birinapant 导致cIAP1 迅速降解、Caspase 活化、PARP 裂解以及核因子-κB 的激活。在一项关于Birinapant 针对晚期实体瘤或淋巴瘤患者的最大耐受剂量（MTD）、安全性和PK/PD 的3+3剂量递增的Ⅰ期试验中，50 例患者分成12 组，进行Birinapant 静脉注射，给药剂量为0.18～63 mg/m2，每周一次，4 周为1 个疗程。Birinapant 的剂量为47 mg/m2被确定为MTD，剂量63 mg/m2为限制毒性剂量（DLT），常见不良反应为头痛、恶心和呕吐。在63 mg/m2剂量时，有2 例患者出现贝尔麻痹症（2 级）。Birinapant 的血浆半衰期为30～35 h，并累积在肿瘤组织中，Birinapant 抑制cIAP1 的活性，并促进PBMC 和肿瘤细胞的凋亡。3 例患者病情稳定达到5～9 个月，其中非小细胞肺癌患者（5 个月），结直肠癌患者（5 个月），脂肪肉瘤患者（9 个月）[30]。Birinapant 本身具有良好的耐受性，临床研究结果进一步证明其联合用药治疗肿瘤的前景。

2.1.8 APG-1387 APG-1387 是由江苏亚盛医药公司研发的一类IAP 二聚体抑制剂，其针对XIAP、cIAP1 和cIAP2 的结合常数Ki 值为1 nmol/L、30 nmol/L 和20 nmol/L。体外研究显示，APG-1387能够有效拮抗含有BIR2和BIR3结构域的XIAP蛋白，在1～10 nmol/L 的浓度时，可诱导cIAP1 的降解，能有效抑制多种癌细胞；且在MDA-MB-231 人乳腺癌和SK-OV-3 卵巢癌细胞系中的IC50值分别达到10 nmol/L 和23 nmol/L。通过流式细胞和蛋白印迹实验显示，APG-1387 在10～100 nmol/L 时可诱导MDA-MB-231 和SK-OV-3 细胞系发生深度凋亡。体内研究表明，在MDA-MB-231 异种移植瘤模型中，每周给药，APG-1387 也能够诱导肿瘤消退。APG-1387 显示出与多西紫杉醇联合用药的协同作用，且在HCC1954 三阴性乳腺癌模型中实现肿瘤消退，没有产生毒性迹象[31]。目前，APG-1387 在中国和澳大利亚均已完成针对晚期实体瘤的临床Ⅰ期剂量爬坡试验。2017年11月，APG-1387 又获得了美国FDA 新药临床试验批准，将与肿瘤免疫药物联合用于治疗晚期实体瘤、恶性血液肿瘤。

2.1.9 UC-112 UC-112 是一种有效的Survivin 抑制剂，其通过蛋白酶体途径选择性降解Survivin 蛋白，激活Caspase3/7 和9 活性，从而导致肿瘤细胞凋亡。体外研究显示，UC-112 针对人黑色素瘤（A375和M14）和人前列腺（PC-3 和DU145）细胞的IC50为0.7～3.4 µmol/L。UC-112 能够有效抑制肿瘤细胞P-糖蛋白的过表达所产生的耐药性，激活Caspase-3/7和Caspase-9活性并在浓度低于1 µmol/L时选择性下调Survivin 水平。UC-112 与已知的蛋白酶体抑制剂Z-Leu-Leu-Leu-CHO（MG-132）的共孵育拯救了Survivin 蛋白抑制，与UC-112 预期作用机制一致。体内研究表明，在A375 异种移植瘤模型中，连续给药3 周，与对照组相比，给药剂量20 mg/kg 时肿瘤生长抑制率（TGI）为（65.59±19.56）%，而40 mg/kg的剂量几乎完全抑制肿瘤生长[TGI 为（95.23±3.11）%]。40 mg/kg 剂量组的平均肿瘤重量仅为对照组的13.56%[32]。UC-112 可通过下调IAP 水平，尤其是Survivin 蛋白可有效抑制肿瘤细胞增殖。

2.1.10 DH-XP-0090 DH-XP-0090 是由布法罗大学和罗斯威尔公园综合癌症中心开发的一种XIAP抑制剂，用于前列腺癌，卵巢癌和肺癌等肿瘤的潜在治疗。在低摩尔浓度（1～20 μmol/L）下，DH-XP-0090 能够抑制PC-3 前列腺癌、P11/2008 卵巢癌，A549 肺癌和MCF-7 乳腺癌细胞生长和集落形成。在1～20 μmol/L 下用DH-XP-0090 处理各种癌细胞，24 h 未出现显著的形态变化，细胞形态在处理24 h 后开始改变，且在处理72 h 后出现显著的形态变化，但未出现细胞膜破裂。DH-XP-0090 对细胞生长的抑制与p21-/-基因呈正相关，与细胞中p53-/-基因呈负相关。DH-XP-0090 除抑制XIAP 蛋白活性外，还可抑制Bcl-2 表达，对XIAP 表达无影响，表明其具有高度特异性[33]。

2.2 IAP 抑制剂作为抗乙型肝炎病毒药物的研究进展

2.2.1 Birinapant 临床前研究显示，在乙型肝炎细胞中，cIAPs 影响肿瘤坏死因子（TNF）信号传导，阻止被感染肝细胞死亡，导致乙肝病毒持续存活。与野生小鼠相比，肝部cIAP1 和全身cIAP2 不足的动物可以有效控制乙肝病毒感染。只是cIAP2 不足的小鼠也会部分表现出这种情况。结果表明，在慢性HBV 小鼠模型中抑制cIAPs 可以促进乙肝病毒的清除，cIAPs 抑制剂Birinapant 能够快速减少血清中的HBV RNA 以及血清中的HBV 表面抗原，促进含有HBV 核心抗原（HBcAg）肝细胞的清除；恩替卡韦能够降低HBV RNA 的复制，Birinapant 能够增强恩替卡韦的疗效。2014年已在澳大利亚开展Birinapant针对乙型肝炎病毒新疗法的临床Ⅰ期试验，该疗法联合了抗病毒药物Entecavir 和抗癌药物Birinapant（美国生物科技公司 TetraLogic Pharmaceuticals研发），其临床结果显示对HBV 病毒清除率达到100%[34]。

2.2.2 APG-1387 APG-1387 是一种新型Smac 拟态物，主要通过模拟内源性Smac 蛋白来抑制IAPs 活性达到诱导和促进细胞凋亡的目的。2018年1月8日江苏亚盛宣布其小分子IAP抑制剂APG-1387针对乙型肝炎病毒的研究已进入临床I 期阶段。在体外，APG-1387 通过减少Treg 分化和下调CD4 T 细胞中的PD1 表达来正调控T 细胞。此外，APG-1387 对记忆T 细胞没有影响。研究证实APG-1387 通过激活核因子-κB 途径来刺激肿瘤细胞上调INF 转录因子，进而刺激免疫系统应答，其在体内/外促进了NK细胞增殖。临床前研究表明，APG-1387 对HBV 阳性的HCC 具有双重抗肿瘤作用，不仅诱导肿瘤细胞死亡，而且能增强抗肿瘤免疫。慢性乙肝患者肝内IAPs 分子表达上调，导致HBV 感染的肝细胞发生免疫逃避，不能被特异性T 细胞杀伤。APG-1387 通过降低PD1 表达和下调Treg 在适应性免疫系统中的应答，促进HBV 病毒的清除，实现治愈HBV 的目标。IAP 抑制剂对肿瘤细胞和免疫细胞具有双重作用，所具有的特异性T 淋巴细胞识别功能，能特异性清除病毒细胞而不影响正常细胞。

3 总结

凋亡抑制蛋白（IAP）是细胞凋亡和促存活信号通路的重要调节因子，其失调通常与肿瘤发生和生长有关。IAP 已成为抗肿瘤治疗的新靶标，已有多个IAP 抑制剂已进入临床试验阶段。通过对IAP 抑制剂继续深入研究发现，其适应证已向抗乙型肝炎病毒延伸，且有两个药物处于临床研究阶段，并取得了预期效果。近年来临床研究结果表明，IAP 抑制剂既可以单独使用促进细胞凋亡，也可与其他抗肿瘤药物联用来避免其他药物的耐药性问题，均证明了其确切疗效。目前，针对IAP 抑制剂的研发仅处于临床研究阶段，尚未有产品上市，随着IAP 抑制剂研究的深入，未来终会将其应用于临床治疗中。