慢性疼痛对孕鼠及其子代认知功能的影响

周芳，李清，闫文靖，刘玉平，涂淑敏

(1.徐州医科大学 护理学院，江苏 徐州 221004； 2.徐州医科大学附属医院 护理部，江苏 徐州 221002；3.北京清华长庚医院 麻醉科，北京 102218)

慢性疼痛是指持续或间歇性地持续3个月以上的疼痛[1]，在普通人群中的发生率为20%～45%[2]。本课题组前期研究发现，44.2%的妊娠期女性发生慢性疼痛，其中53.3%的人出现抑郁，30.4%的人出现焦虑症状[3]。在动物实验中，我们发现孕期慢性疼痛的孕鼠体重增加值显著低于对照组孕鼠，且有早产情况，其平均孕期、产仔数均低于对照组，但活产率及子代性别比与对照组相比无统计学差异[4]。除此以外，慢性疼痛还常伴有认知功能的改变，如学习、记忆障碍，近80%的慢性疼痛患者认为自己记忆力减退[5]。母体妊娠期慢性疼痛是否会出现认知功能减退？其子代认知功能是否也会受到影响？至今还未有报道。

本研究拟通过构建孕期小鼠慢性炎性痛模型，观测慢性疼痛对孕鼠及其子鼠认知功能的影响，以揭示孕期慢性疼痛对母体和子代健康的危害。

1 材料与方法

1.1 材料

选用未受孕过的SPF级昆明小鼠(由徐州医科大学实验动物中心提供，动物使用许可证号：SYXK 2002- 0038)，65～80日龄，雌性，体重33～35 g，同批交配。10～12 h后阴道栓或阴道涂片发现精虫者定为妊娠第0天。选取30只成功受孕小鼠，随机分为正常组、假手术组和慢性疼痛组，每组10只。子鼠出生后剔除死胎、发育畸形、先天残疾小鼠后对其进行编号，用随机数表法分别选出正常组子鼠、假手术组子鼠和慢性疼痛组子鼠，各10只。所有子代小鼠均按常规方式饲养。

1.2 方法

1.2.1 孕鼠慢性疼痛模型的制备 慢性关节炎疼痛模型：母鼠交配成功后，在异氟醚麻醉下围绕左后足的足跖关节处选择两点，皮内注射无菌完全弗氏佐剂(CFA)100 μl(即500 μg)，诱导产生关节炎性痛。在注射后24 h即出现热痛觉阈值的降低并可维持4周以上，持续整个孕期(22 d左右)至产后1周。在造模后第1、7、14、21天及产后第7天分别监测模型组小鼠痛阈值，疼痛敏感性降低(热缩足潜伏期延长)的小鼠追加注射CFA 1次，确保在造模后的28 d内慢性疼痛组小鼠维持稳定的较低痛阈值(始终处于疼痛状态)。

假手术组母鼠用同样麻醉方式、同样注射方法、同样注射部位注入同体积无菌PBS。正常组常规饲养，不作任何处理。

1.2.2 孕鼠及其子鼠认知行为监测 用Morris水迷宫实验(包括定位航行和空间搜索实验)检测母鼠及子鼠认知(学习和记忆)功能。各组孕鼠在造模后6～12 d测试，各组子鼠分别于出生后3周(幼年期，可离乳独立生活)、6周(青春期)、9周(成年期)测试。

定位航行实验：用于检测学习能力。实验时平台固定在NW象限，位于水面下1 cm。实验历时6 d，训练第1天(造模后第6天)让小鼠自由游泳1 min；从第2天(造模后第7天)起，每天每只小鼠测试4次，每次将小鼠面向池壁轻放入水中。第1次和第4次从目标象限对侧的象限(SE)入水，第2次和第3次随机从SW和NE象限入水。小鼠游泳的监测时间为120 s，计算机采集系统自动记录从小鼠入水到找到隐藏平台的数据和过程，从小鼠入水到找到平台的时间记为逃避潜伏期。如小鼠在60 s内未找到平台，须将其引至平台，这时潜伏期计为60 s。取小鼠4次潜伏期的算术平均数作为当天的平均逃避潜伏期。每次训练完，用干毛巾将小鼠擦干，以防止低体温造成的应激，让小鼠休息60 s后开始下一次训练。

空间搜索实验：用于检测记忆能力。在定位航行试验结束后(训练第7天，即造模后第12天)撤除平台，从SE象限将小鼠放入水中，记录小鼠60 s内搜寻平台的运动轨迹、在原平台所在象限的停留时间、游程占总时间(时间比率)和总游程(游程比率)的百分比、平均游速及穿越原平台区的次数。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 疼痛模型效果检测

采用热缩足潜伏期检测判断动物疼痛阈值变化,结果见图1A。由图1A可见，造模后第1至28天，慢性疼痛组孕鼠在各时间点热缩足潜伏期均显著低于假手术组孕鼠，提示造模后孕鼠在整个孕期及产后早期始终处于疼痛状态(P<0.001)。慢性疼痛组孕鼠热缩足潜伏期在各时间点差异无统计学意义(P>0.05)，提示孕鼠整个孕期疼痛较为稳定。以上结果提示疼痛模型造模成功。

2.2 慢性疼痛对母鼠认知行为的影响

在定位航行实验中，经过第1天的熟悉环境后，第2天各组孕鼠均能在60 s内找到平台，各组平均逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。第3天至第6天，孕鼠平均逃避潜伏期慢性疼痛组均长于假手术组孕鼠(P<0.001)，见图1B。在空间搜索实验中，孕鼠穿越平台次数、平均游速、在原平台象限停留的时间比率及游程比率慢性疼痛组均显著低于假手术组(P<0.05)，见表1。

2.3 慢性疼痛对子鼠认知行为的影响

见图1C及表2。

与假手术组孕鼠或子鼠比较，aP<0.001，bP<0.01

A.孕鼠热缩是潜伏期检测；B.孕鼠平均逃避潜伏期检测；C.子鼠出生后第3周平均逃避潜伏期检验

图1各组孕鼠、子鼠行为学比较

表1各组孕鼠空间搜索能力比较(n=10)

组 别平均游速/cm·s-1穿越平台数/次·(60 s)-1时间比率/%游程比率/%正常组20.19±0.884.59±1.2342.31±3.8545.13±2.79假手术组22.20±1.864.71±0.8738.04±4.1642.73±3.12慢性疼痛组19.35±1.47a1.18±1.29b26.36±3.97c24.66±2.21b

与假手术组比较，aP<0.05，bP<0.01，cP<0.001

表2各组子鼠出生后3周空间搜索能力比较(n=10)

组 别平均游速/cm·s-1穿越平台数/次·(60 s)-1时间比率/%游程比率/%正常组19.33±1.674.32±1.5739.47±4.1743.29±3.54假手术组20.79±1.624.26±1.2140.33±4.2843.87±3.58慢性疼痛组19.52±1.333.19±1.53a39.31±3.8642.15±3.16

与假手术组比较，aP<0.05

由图1C可见,在子鼠出生的第3周期间，慢性疼痛组子鼠平均逃避潜伏期显著长于假手术组子鼠(P<0.01)。在出生后第6周和第9周，两组子鼠平均逃避潜伏期无统计学差异(P>0.05)。在空间搜索实验中，出生后第3周慢性疼痛组子鼠穿越平台次数少于假手术组子鼠(P<0.05)，平均游速、在原平台象限停留的时间比率和游程比率与假手术组子鼠比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。至其出生后第6周和第9周，各组子鼠在定位航行实验和空间搜索实验中各项监测指标均无统计学差异(P>0.05)。

3 讨 论

国际疼痛研究协会将疼痛定义为一种与组织损伤或潜在组织损伤相关的感觉、情感、认知和社会维度的痛苦体验[6]。与疼痛的感觉相比，有关疼痛状态下认知功能的减退一直没有得到足够的关注，这也是临床治疗中常被忽视的部分。本研究结果显示，孕期慢性疼痛可导致孕鼠认知能力下降。有研究指出，认知能力减退主要与患者慢性疼痛强度、负性情绪和镇痛药的使用等有关[7]。本课题组前期研究发现，无论是人类孕妇还是怀孕小鼠，如罹患慢性疼痛均会出现抑郁[3,8]。因此我们推测，本研究中母鼠认知能力的下降与其慢性疼痛的持续存在有关，也可能与慢性疼痛导致的抑郁情绪有关。

关于慢性疼痛导致认知障碍的机制，Van Ryckeghem提出，学习记忆、抑郁和疼痛在脑内调控过程中是竞争关系，当慢性疼痛引发负性情绪出现时，涉及信息加工整合的记忆功能就会受影响[9]。已有研究表明，疼痛与记忆、抑郁存在共同的中枢神经通路，与疼痛有关的中枢神经结构如前额叶皮质、杏仁核、丘脑、海马等脑区，同时也是记忆神经通路的一部分，在焦虑抑郁的发生过程中也起到一定的作用[10]。此外，疼痛、抑郁和记忆所涉及的边缘神经网络系统也存在部分重叠现象，神经影像学研究证实，这些区域在疼痛、抑郁和记忆的加工过程中被激活[11]。因此，未来关于慢性疼痛导致负性情绪、认知障碍机制的研究，从神经环路机制着手可能是比较合理的做法。

本研究还发现，在子鼠出生后3周的定位航行实验中，慢性疼痛组子鼠的学习能力显著差于假手术组子鼠，而在其出生后6、9周的定位航行实验中，各组子鼠学习能力无统计学差异。提示子鼠在出生后早期有一定程度的学习障碍，但随着生长发育逐渐成熟，其学习能力可恢复至与正常小鼠无异。我们曾经报道孕期慢性疼痛可导致其新生鼠的尾长、体重及行为表征(平面翻正达标率、爬行达标率)显著差于正常组新生鼠[4]。但慢性疼痛组子鼠出生后第3周在空间搜索实验中，其平均游速与假手术组子鼠相比无差异，说明其水中运动能力与正常小鼠相比无显著性差异，这提示胎内发育不良在成长过程中有逐渐改善的可能。

水迷宫实验对啮齿类动物认知功能检测具有良好的可信性[12]，在较多慢性疼痛研究中亦有应用[13]。本研究中慢性疼痛模型是小鼠左后足足跖关节炎症模型，肢体疼痛对动物的运动可能会有一定的影响。但本研究定位航行实验测试的第1天，各组孕鼠均能在60 s内找到平台，各组平均逃避潜伏期差异无统计学意义(P>0.05)。说明本实验条件下，后足痛对孕鼠在水中运动能力的影响并没有显著干扰水迷宫对其认知能力测试的可信性。但是研究者应寻求更加科学合理的认知检测方法，最大程度地避免运动能力受限有可能对认知功能检测带来的干扰。

综上所述，孕期慢性疼痛会导致母体认知能力的下降，也可能会影响其子代早期的脑认知功能。人们对于慢性疼痛的研究应关注到孕妇这一特殊人群，对于慢性疼痛机制的研究不应局限于疼痛本身，对慢性疼痛引发的抑郁焦虑、认知功能下降的发生机制也应当予以足够的重视。