枸杞多糖对H2O2诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及Beclin- 1、LC3B表达的影响

曹茜,杨玉倩,左晶,魏伟

(南京中医药大学附属医院 眼科，江苏 南京 210029)

年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)是一组发生于50岁以上中老年人的病变累及黄斑区视网膜色素上皮、感光细胞层和脉络膜多层组织从而造成视力进行性损害的眼科疾病[1]。在我国,AMD居致盲原因的第3位[2]。

AMD的发病机制不明确，目前假说主要包括氧化刺激学说、老龄化学说、炎性免疫学说等[3- 5]。研究显示，枸杞多糖(lyciumbarbarumpolysaccharide,LBP)对蓝光照射或过氧化物诱导的氧化损伤模型的视网膜色素上皮细胞(ARPE- 19)具有保护作用[6- 7]。

近年来，自噬在眼部疾病方面的研究不断增加，干性AMD中，细胞溶酶体结构破坏、氧化应激等能激活免疫炎症反应，而细胞中自噬的异常可能加剧这一反应，促进干性AMD病变的发展[5,8]。在AMD的发生、发展过程中，视网膜的氧化应激与细胞自噬之间相互作用，触发并推动AMD[9]。因此，本研究将观察氧化应激与ARPE- 19细胞自噬之间的关系，并予以LBP进行干预，观察ARPE- 19细胞Beclin- 1、LC3B蛋白表达的变化，以期探讨LBP的作用机制，为临床运用LBP防治AMD提供思路与依据。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

LBP购自南京朗泽医药科技有限公司，过氧化氢(H2O2)购自美国Amresco公司。RPMI- 1640培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶购自美国GIBCO公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。蛋白质印迹法中使用的自噬基因Beclin兔抗人单克隆抗体、LC3B单克隆抗体购自英国Abcam公司，抗β- Actin购自英国Bioworld Technology公司。ECL发光试剂盒购自英国GE Healthcare公司。

1.2 细胞系及细胞培养

ARPE- 19细胞购自美国ATCC公司。取对数生长期的ARPE- 19细胞，以密度为105个·mL-1接种于6孔板中，用RPMI- 1640培养液，置于37 ℃、5% CO2环境中培养。

1.3 主要仪器

电泳仪(美国Bio- Rad)、化学发光成像仪(美国Bio- Rad ChemiDoc XRS+)、核酸蛋白测定仪(美国ThermoNanodrop 2000)。

1.4 方法

1.4.1 透射电镜观察H2O2诱导ARPE- 19细胞自噬的情况 设未经H2O2诱导的ARPE- 19细胞为对照组，经H2O2诱导12 h的细胞为实验组(H2O2浓度分别为200、400、600 μmol·L-1)，收取各组细胞置于3%戊二醛中固定、PBS洗涤、1%锇酸固定、梯度乙醇丙酮脱水、包埋、聚合、超薄切片、铅染后，采用透射电镜观察细胞自噬变化[10]。

1.4.2 蛋白质印迹法检测LBP对H2O2诱导ARPE- 19细胞自噬的影响 设未经处理的ARPE- 19细胞为对照组，经不同浓度H2O2处理的ARPE- 19细胞(H2O2浓度分别为200、400、600、800 μmol·L-1)，以及经过H2O2(400 μmol·L-1)和LBP(10、100、1 000 μg·ml-1)共同处理后的ARPE- 19为实验组。收集对数生长期细胞，PBS冲洗2次，加入RIPA裂解液抽提细胞总蛋白并定量。将蛋白提取液置于12% SDS- PAGE电泳分离，半干法转膜，加入5%脱脂牛奶孵育封闭1 h。分别加入相应一抗：LC3B(1∶1 000)、Beclin- 1(1∶1 000),于4 ℃条件下孵育过夜，以PBST洗膜，室温条件下以1∶5 000的抗体滴度孵育二抗2 h，用PBST洗膜。用ECL化学发光显影试剂盒显影，以β- Actin作为内参照，扫描目的条带和内参条带,采用Image Lab 5.0分析数据。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 H2O2对ARPE- 19细胞自噬表达的影响

不同浓度H2O2诱导ARPE- 19细胞12 h后，H2O2200 μmol·L-1组自噬表达不明显，H2O2600 μmol·L-1组自噬体数量明显增加，显示自噬表达显著增加。见图1。

A.对照组；B.H2O2200 μmol·L-1组；C.H2O2400 μmol·L-1组；D.H2O2600 μmol·L-1组

图1不同浓度H2O2对ARPE-19细胞自噬表达的影响

2.2 LBP对H2O2诱导后的ARPE- 19细胞Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达的影响

不同浓度H2O2诱导后，ARPE- 19细胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达升高，与对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)。H2O2浓度越高，ARPE- 19细胞的Beclin、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达越高，LC3BⅡ/LC3BⅠ值也越高，呈现浓度依赖。加入LBP后，随着浓度增加，ARPE- 19细胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3B Ⅱ 表达降低，LC3B Ⅱ /LC3B Ⅰ值也降低。与H2O2400 μmol·L-1组比较，1 000 μg·mL-1LBP+400 μmol·L-1H2O2组ARPE- 19细胞的Beclin- 1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达显著降低(P<0.01)。见表1及图2。

组 别Beclin-1LC3BⅠLC3BⅡLC3BⅡ/LC3BⅠ值空白对照组0.32±0.06a0.37±0.07a0.20±0.05a0.51±0.11aH2O2组 200 μmol·L-10.46±0.09b0.63±0.10ab0.51±0.06ab0.79±0.13b 400 μmol·L-10.62±0.11b0.83±0.11b0.69±0.10b0.83±0.14b 600 μmol·L-10.86±0.10b1.29±0.13ab1.02±0.13ab0.89±0.17b 800 μmol·L-10.90±0.14ab1.31±0.14ab1.15±0.17ab0.93±0.14bLBP+H2O2组 10 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.64±0.07b0.85±0.08b0.80±0.07b0.91±0.15b 100 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.56±0.08b0.74±0.07b0.62±0.06b0.78±0.12b 1 000 μg·ml-1LBP+400 μmol·L-1 H2O20.49±0.06ab0.54±0.07ab0.39±0.04ab0.61±0.10a

与H2O2400 μmol·L-1组比较，aP<0.01；与空白对照组比较，bP<0.01

与对照组比较，aP<0.01；与400 μmol·L-1H2O2组比较，bP<0.01

A.LBP对H2O2诱导ARPE- 19细胞Beclin- 1蛋白表达影响；B.LBP对H2O2诱导ARPE- 19细胞LC3BⅠ和LC3BⅡ蛋白表达影响

图2LBP对H2O2诱导ARPE-19细胞Beclin-1、LC3BⅠ和LC3BⅡ表达的影响

3 讨 论

AMD是一组发生于50岁以上中老年人的病变累及黄斑区视网膜色素上皮、感光细胞层和脉络膜多层组织从而造成视力进行性损害的眼科疾病[11]。在西方国家AMD是导致老年人视力残疾的首要病因[12]，是目前亟待解决的临床问题。

本研究发现，H2O2诱导ARPE- 19细胞12 h后，H2O2200 μmol·L-1组自噬体表达不明显，H2O2600 μmol·L-1组自噬体表达显著增加，证实H2O2能够诱导ARPE- 19细胞自噬水平的升高。Beclin 1是参与自噬调控的重要基因，主要通过与磷酸肌醇三磷酸激酶Ⅲ型PIK形成复合体，来调控其他自噬蛋白的表达强度，与自噬活性密切相关[13- 14]。本研究发现，H2O2诱导后，ARPE- 19细胞Beclin- 1表达比对照组明显升高(P<0.01)，而且呈现H2O2浓度依赖。加入LBP后，随着浓度增加Beclin- 1表达降低。可见，LBP对H2O2诱导所致自噬水平升高有干预作用。

LC3B有两种存在形式，LC3BⅠ存在于胞浆中，LC3BⅡ与磷脂结合存在于细胞膜上[15]。自噬体的形成需要LC3B的修饰调节，LC3BⅡ是自噬体的标记物。当自噬增强时有更多的LC3BⅠ向LC3BⅡ转变。因此，通过监测LC3BⅡ/LC3BⅠ值可以了解自噬的变化[16]。本研究发现，在单纯H2O2诱导组中,随着H2O2浓度增加LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ 值升高，呈现浓度依赖。H2O2诱导基础上加入不同浓度LBP干预，随着LBP浓度增加LC3B Ⅱ/LC3B Ⅰ值降低，并呈现浓度依赖。与H2O2400 μmol·L-1组比较，1 000 μmol·L-1LBP+400 μmol·L-1H2O2组的LC3BⅡ/LC3BⅠ值显著降低(P<0.01)。综上所述，LBP能够干预H2O2诱导所致ARPE- 19细胞的自噬水平升高，1 000 μmol·L-1浓度时效应最为显著。