海扇壳源性碳酸钙纳米微粒的急性毒性作用研究*

付文亮，邵春燕，崔鼎豪，陈志宏△

（1.承德医学院人体解剖学教研室， 河北承德 067000；2.中国人民解放军联勤保障部队第九八一医院口腔科；3.新疆医科大学临床医学系）

近几十年来，纳米微粒在抗癌药物载药体系中的应用受到了广泛关注。与传统的抗癌药物相比，纳米载药体系具有更高的肿瘤微环境靶向选择性和实体瘤高通透性[1]。与其它载药体系相比，生物源性碳酸钙纳米微粒（calcium carbonate nanoparticles，CCNPs）具有良好的生物相容性、生物降解性和pH敏感性，展现了作为载药体系的强大潜力[2]。本课题组前期研究已经成功用海扇壳制备了CCNPs，并发现阿霉素装载的CCNPs能有效杀灭骨肉瘤细胞，所使用的海扇贝由纯文石型碳酸钙自然组成[3-4]。但是，目前国内外还没有相关的实验研究报道CCNPs体内注射的安全剂量。本研究将首次探讨静脉注射海扇壳源性CCNPs在大鼠体内的急性毒性效应，为CCNPs在生物医学和药物应用中的安全性评价提供可靠的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂、药品与动物 海扇壳购自马来西亚当地市场，十二烷基二甲基胺乙内酯（dodecyl dimethyl betaine，BS-12）购自美国Sigma-Aldrich公司。

五周龄清洁级雌性SD大鼠，重量140～170g，购自于马来西亚博特拉大学兽医学院动物资源部门，饲养于恒温（25±3℃）、恒湿（55±5%）的环境中。本研究的动物实验方案由博特拉大学实验动物伦理委员会批准（批准号：UPM/IACUC/AUP-R027/2015)。

1.2 CCNPs的制备 将洗净干燥的海扇壳打碎研磨，过75 μ m实验筛得到微米级的粉末。5g微米级粉末加50ml去离子水在磁力搅拌器中70℃、1300r/min搅拌1h；将1ml BS-12加入到上述混悬液中，室温、1000r/min搅拌110min；过滤收集CCNPs，于70℃烘箱中干燥2d，备用。使用前紫外线照射CCNPs粉末灭菌2h，用无菌生理盐水配制成所需浓度。

1.3 CCNPs表面形态的观察 透射电子显微镜观察CCNPs的形状并测量大小。

1.4 14天重复剂量毒性试验 SD大鼠随机分为四组，CCNPs低、中、高剂量组和对照组，每组6只。CCNPs低（30mg/kg/d）、中（60mg/kg/d）、高（120mg/kg/d）剂量组大鼠分别给予不同剂量的CCNPs尾静脉注射，连续14d；对照组大鼠每天给予等量生理盐水尾静脉注射，连续14天。

1.4.1 毒性反应观察和体重测量：每天观察大鼠的死亡情况、毒性反应和行为异常，如皮肤、皮毛、眼睛或自主活动的改变，步态和姿势的变化；同时，每天记录大鼠的体重。

1.4.2 组织病理学检查：分别取大鼠肝脏、肺、脾、肾和心脏，10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，连续切片，片厚5 μm，HE染色，普通光学显微镜观察并拍照。

1.5 统计分析 所有数据采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。数据以（±s）的形式表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05时为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CCNPs的形貌与表面特性 透射电子显微镜下观察显示，本研究制备的CCNPs为球形，直径为20～60nm，为多孔性质（图1）。CCNPs的多孔特性有助于其通过物理吸附作用装载药物到纳米粒子。

图1 透射电子显微镜下CCNPs的形貌

2.2 14天重复剂量毒性试验

2.2.1 各组大鼠的生存率和毒性反应观察：实验结束时，低剂量组和对照组大鼠生存率为100.00%（6/6），中剂量组大鼠生存率为66.67%（4/6）、高剂量组大鼠生存率为50.00%（3/6）。整个实验过程中，低剂量组大鼠日常表现与对照组大鼠无明显差别；在中剂量组和高剂量组，一些大鼠出现皮毛粗糙、自发活动减少等表现。CCNPs三个剂量组大鼠均未发现注射部位局部损伤病变。

2.2.2 各组大鼠的体重：在实验过程中，CCNPs各给药组和对照组大鼠的体重均逐渐增加。实验结束时，CCNPs低剂量组、中剂量组大鼠体重与对照组大鼠相比，差异无统计学意义(P＞0.05)；CCNPs高剂量组大鼠体重显著低于对照组大鼠(P＜0.05)。见图2：

图2 各组大鼠体重的变化

2.2.3 组织病理学观察：主要脏器的病理学变化见图3。⑴肝脏：低剂量组，大鼠肝细胞仍以条索状排列，可见轻度的空泡变性和淋巴细胞浸润；中、高剂量组，大鼠肝细胞排列轻度紊乱，肝细胞内空泡增多，可见大量炎性细胞浸润。⑵肺：与对照组相比，低剂量组大鼠肺泡间隔膜增厚且伴有炎性细胞浸润，肺间质中可见轻度肉芽肿形成；在中、高剂量组，大鼠肺可见大量炎性细胞浸润，肺泡间质增厚及大量肉芽肿形成。⑶脾：CCNPs各给药组大鼠脾脏的形态结构发生了明显病理变化，尤其是中、高剂量组大鼠，且高剂量大鼠脾脏白髓的轮廓不规则或消失。⑷心脏：低剂量组，大鼠心脏切片可见轻度炎性细胞浸润；中剂量组，大鼠心肌细胞间质中有明显扩张充血的血管，红细胞外渗和中度炎性细胞浸润；高剂量组，大鼠心肌纤维肿胀、断裂甚至坏死，伴有严重的淋巴细胞浸润。⑸肾：低剂量组，大鼠肾脏切片未见明显病理改变；中、高剂量组，大鼠肾脏切片可见明显病理变化，如肾小球萎缩和系膜区明显增宽，扩张毛细血管内淤血明显。

图3 大鼠各脏器HE染色结果

3 讨论

传统抗癌药物由于缺乏对肿瘤组织细胞的靶向性，在杀灭肿瘤细胞的同时也会损害正常的组织细胞，造成剂量相关的毒副作用[5-6]。随着纳米技术的发展，具有肿瘤组织细胞靶向性的纳米载药体系可以在增加药物抗癌效果的同时，减少对正常组织的毒副作用。作为具有良好生物相容性载药体系的CCNPs，至今其体内使用的安全剂量及具体的生物学效应尚不清楚。为此，本研究采用14天连续静脉注射的给药方式，初步探究了不同剂量CCNPs对雌性SD大鼠的急性毒性作用。

本研究显示，CCNPs低剂量组大鼠全部存活，中、高剂量组大鼠存活率分别为66.67%和50.00%，并且大鼠死亡之前均出现了不规则呼吸和严重嗜睡等毒性反应。体重减轻是一个简单而灵敏的毒性实验指标[7]。本研究发现，CCNPs低、中剂量组大鼠体重与对照组大鼠比较差异无统计学意义，而高剂量组大鼠的体重与对照组比较明显降低。本研究结果提示，高剂量CCNPs连续14天静脉注射可能通过影响雌性大鼠的正常代谢导致了大鼠体重增长的减慢；同时，高剂量组中部分大鼠出现了皮毛粗糙、自发活动减少等毒性反应的表现。

组织病理学分析是观察药物毒性作用引起器官微观结构变化的可靠方法[8]。本研究组织病理学观察发现，CCNPs暴露引起的组织病理学改变主要是肺、肝、脾、肾和心脏的炎性细胞浸润，其机制可能是纳米微粒进入体内激活了机体的免疫应答，在免疫应答期间促炎性细胞因子释放增加，进而可能导致氧化应激反应或细胞损伤的发生[9]。同时，本研究还发现，CCNPs低剂量组大鼠肝脏、脾、肺、心脏和肾脏的病理变化较轻或未观察到明显病理变化，而中、高剂量组大鼠各脏器的病理变化明显较重。

综上所述，雌性大鼠14天重复剂量急性毒性实验中，小剂量的CCNPs静脉给药不会引起严重的急性毒性反应，即CCNPs对于雌性大鼠的安全剂量为≤30mg/kg，本研究可为CCNPs在生物医学和药物应用中的安全性评价提供可靠的实验依据。