侧脑室注射瘦素对OEP大鼠子宫腔液MMP-7蛋白的调节作用*

2019-01-25 06:10司丽娜乔跃兵程露阳杨松鹤
承德医学院学报 2019年1期
关键词:子宫腔瘦素侧脑室

司丽娜,陈 磊,魏 萌,乔跃兵,程露阳,杨松鹤△

(1.承德医学院基础医学院,河北承德 067000;2.沧州医学高等专科学校)

瘦素(leptin)最初只被认为是一种抗肥胖激素[1],但瘦素是一种具有多种生物学作用的激素,在能量平衡、摄食、炎症、血管发生、造血功能、免疫调节及生殖方面发挥着重要作用[2]。研究发现,瘦素可通过影响下丘脑-垂体-性腺轴,调节促性腺激素释放激素的分泌,进而影响妊娠、胚胎植入、胚胎发育等生殖过程;此外,瘦素系统的紊乱还与先兆子痫、多囊卵巢综合征等生殖系统疾病有关[2]。然而,瘦素在生殖方面的作用还有很多问题处于争论中,还需要更深入的研究。为深入探讨瘦素在雌性哺乳动物生殖功能调节中的作用,本研究采用蛋白质组学技术结合蛋白印迹法,对侧脑室微量注射瘦素后卵巢摘除术补充雌激素(OEP)大鼠模型子宫腔液差异蛋白进行鉴定,发现瘦素对子宫腔液基质金属蛋白酶-7(MMP-7)的表达具有调控作用,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 脑立体定位仪,日本Narishige公司;等电聚胶电泳仪,美国GE公司;Power PAC 3000型电泳仪、Minigel电泳槽及电转移装置,美国Bio-Rad公司。

瘦素,美国Peprotech公司;丙烯酰胺、N,N’-甲叉双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS),美国Sigma公司;IPG缓冲液(immobilized pH gradient, pH 3-10NL)、蛋白提取试剂盒(2D clean-up Kit)、蛋白质定量试剂盒(2D Quant Kit),美国Amersham Biosciences公司;固相pH梯度干胶条(IPG strip,pH 5-8,7cm),美国Bio-Rad公司;蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ),德国Calbiochem公司。

1.2 动物模型的建立及分组 健康成年雌性Wistar大鼠16只,河北医科大学实验动物中心提供(清洁级,合格证编号806071),均行双侧卵巢摘除术。术后第15天起项部皮下注射17β-雌二醇(0.1mg/kg/d),连续注射5d,建立OEP大鼠模型。

成模大鼠随机分为瘦素注射组及生理盐水注射组(n=8),分别侧脑室微量注射瘦素、生理盐水4μl。微量注射6h后,打开腹腔抽取子宫腔液,-80℃保存备用。

1.3 双向凝胶电泳 采用2D clean-up试剂盒提取子宫腔液蛋白质,2D Quant Kit测定蛋白浓度后,根据Grg的方法进行双向电泳[3]。第一向等电聚焦采用线性固相胶条(IPG Strip,pH5-8,7cm);等电聚焦完成后,第二向用SDS-PAGE电泳(12%分离胶,4%堆积胶)进行分离。扫描凝胶获取图像,使用ImageMasterTM 2D Platinum 5.00软件进行分析。

1.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)鉴定 2D胶切下的差异表达蛋白斑点由北京华大蛋白质研发中心有限公司进行MALDI-TOF-MS鉴定,获得肽混合物的肽质量指纹谱(PMF),并于SwissProt蛋白数据库中进行检索。

1.5 Western blot法验证 大鼠宫腔液蛋白经SDS-PAGE(12%分离胶,4%堆积胶)电泳分离,然后将蛋白电转移(200mA,60min)至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭30min,兔抗MMP-7一抗(1:1000)4℃孵育过夜,羊抗兔IgG-AP(1:3000)孵育2h,洗膜后BCIP/NBT显色观察结果。图像扫描后采用Image J分析软件分析条带的平均灰度值,确定条带中的蛋白含量。

1.6 统计分析 使用SPSS 19.0软件进行统计分析,实验数据以(±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 双向电泳分离大鼠子宫腔液蛋白质 通过建立分辨率高、重复性较好的大鼠子宫腔液蛋白双向电泳图谱(本实验重复次数>5),选择12%的2-DE胶图中的差异目的蛋白点。见图1:

图1 OEP大鼠子宫腔液蛋白双向电泳图谱

2.2 MALDI-TOF-MS肽质量指纹图鉴定差异表达蛋白质点及数据库检索 将图1所示差异蛋白质点从凝胶中切下,经胰酶消化后进行MALDI-TOF-MS分析,经Mascot数据库检索,鉴定该蛋白为基质金属蛋白酶-7(MMP-7)。见附表:

附表 MALDI-TOF-MS鉴定差异蛋白

2.3 Western blot法结果 侧脑室微量注射瘦素6h后,OEP大鼠子宫腔液MMP-7蛋白的表达显著高于生理盐水对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2:

图2 OEP大鼠子宫腔液MMP-7蛋白的表达

3 讨论

瘦素(leptin)是肥胖基因(ob)的表达产物,是脂肪细胞分泌的一种由167个氨基酸组成的蛋白质,具有多种生物学作用,如能量平衡、血管生成、神经内分泌等[1]。此外,瘦素还与生殖功能有关,如调节卵巢功能、卵母细胞成熟、胚胎植入与胎盘形成等[4-5];同时,生殖功能受损与瘦素及瘦素受体缺陷的相关性也提示了瘦素与生殖功能的关系[6]。研究发现,瘦素不仅通过对下丘脑(如弓状核、腹内侧核等)、垂体系统影响促性腺激素释放激素(GnRH)和促性腺激素的分泌,还可直接调节生殖器官的功能,如卵巢、子宫[7]。例如,瘦素及其受体在整个月经周期的子宫腺上皮细胞及腔上皮细胞中均有表达[8-9];在增生期早期,瘦素受体(LEPR)的表达逐渐升高,在分泌期早期达到峰值,提示瘦素可能在受精卵植入中发挥作用[10]。

为深入分析瘦素对生殖功能的调节作用,本研究在建立OEP大鼠模型后给予大鼠侧脑室微量注射瘦素(4 μl),并采用蛋白质组学结合蛋白印迹的方法对大鼠子宫腔液蛋白进行差异分析和鉴定,以探讨瘦素是否通过下丘脑-垂体系统对下游靶器官进行调节。结果显示,通过对差异蛋白的鉴定发现侧脑室微量注射瘦素后可正向调节OEP大鼠子宫腔液中MMP-7的表达。基质金属蛋白酶(MMPs)包括一系列能降解多种细胞外基质组分的酶,可参与月经周期、胚胎发育、组织重塑、肿瘤侵袭及转移等多种生物学过程[11]。MMPs家族中的MMP-7表达于子宫内膜腺上皮细胞和子宫平滑肌细胞,能降解多种细胞外基质蛋白,如蛋白聚糖、纤连蛋白、巢蛋白、层粘连蛋白和弹性蛋白等[12]。MMP-7在月经周期中的增殖期及月经期在子宫腺上皮细胞中高表达,而在分泌期早期的子宫内膜基底层和功能层中不表达,因此提示,MMP-7可能与子宫内膜的周期性变化有关[13-14];而他们的研究还发现,MMP-7在子宫内膜增生及子宫内膜癌中的表达明显升高[13-14];而子宫内膜癌患者血清瘦素水平明显高于健康对照组[15]。上述研究结果表明瘦素和MMP-7均与子宫内膜癌的发生发展有关,二者可能在女性生殖系统肿瘤的发生发展过程中具有相互作用,但具体作用机制不明确。

综上所述,大鼠侧脑室微量注射瘦素,可在一定时间内正向调节大鼠宫腔液MMP-7蛋白的表达,但具体机制有待深入探讨;另外,本研究结果可能为探究女性生殖系统疾病时瘦素、MMP-7的作用机制,以及二者的相关作用提供有价值的启示。

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