二甲双胍对Eca-109食管癌细胞迁移能力的影响及机制研究*

于敬坤，韩学超，李明志，随振阳，张 琪，王长友

1.华北理工大学附属医院普外科(唐山 063000);2 华北理工大学医学实验研究中心 (唐山 063000)

我国是肿瘤大国，恶性肿瘤发生率、病死率均高于世界平均水平，有研究指出我国肿瘤发病率正以每年3%～5% 的速度增加，病死率也由20 世纪70 年代以来一直呈上升趋势[1-4]。食管癌是我国常见十大恶性肿瘤之一，具有高发病率、高病死率等特点。Kobayashi等[5]的体外研究表明，二甲双胍可通过下调食管癌细胞周期的相关蛋白，抑制其生长、增殖。本实验通过检测Eca-109食管癌细胞在盐酸二甲双胍的作用下，其增殖能力、迁移能力的变化，观察迁移相关蛋白的改变，探索二甲双胍影响Eca-109食管癌细胞迁移能力的机制。

材料与方法

1 材 料 恶性肿瘤细胞株：Eca-109食管癌细胞获赠于华北理工大学医学实验研究中心。主要试剂及仪器：DMEM完全培养基[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司]；胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青链霉素混合液、胰蛋白酶(美国Gibco分司)；盐酸二甲双胍(北京索莱宝科技有限公司)；MTT试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)；96孔板、6孔板(德国Eppendorfna分司)；酶标仪、显影仪、电泳转膜相关器材(上海Bio-Rad公司)；MMP-14、GLUT1抗体(台湾Arigo公司)；MMP-2、MMP-9抗体(美国Cell Signaling公司)；β-Actin抗体[天徳悦(北京)生物科技有限责任公司]；HRP标记山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技术研究所)等。

2 方 法 ①细胞培养：Eca-109食管癌细胞是用细胞培养液(含10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM完全培养基)培养，并置于37℃恒温、95%O2、5%CO2空气孵箱中(相对湿度95%)。依据细胞密度按1∶2或1∶3比例传代(传代时间约为2～3 d)，Eca-109食管癌细胞呈贴壁生长，待形成致密单层细胞，利用胰蛋白酶消化并形成均匀单一的游离细胞后，取生长状态良好的对数生长期细胞进行实验。② MTT实验检测细胞增殖情况：将Eca-109食管癌细胞均匀地播种于96孔板中(每个培养孔内约有104个细胞)，待细胞完全贴壁后，给予含有不同浓度盐酸二甲双胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml)的细胞培养液培养。24 h后，移除培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水冲洗细胞两次(避免药物与MTT试剂反应而未形成结晶或未完全形成结晶)。在每孔中加入了100 μl的不含药物的单纯细胞培养液及10 μl浓度为5 mg /ml的MTT试剂(MTT溶于PBS液或生理盐水中)。将96孔板置于恒温箱中孵化4 h以上，待紫蓝色结晶完全形成，小心移除DMEM完全培养基(尽量避免吸走结晶)，然后每个孔内都注入100 μl的二甲基亚砜溶液(DMSO)，并置于摇床上中速摇匀10 min。结晶完全溶解后，使用酶标仪测各孔在490 nm波长处的吸光值(OD值，OD值可反映各孔相对细胞数量，间接反映细胞增殖能力)。重复实验3次，SPSS Statistic 17.0软件评估所测数据。根据药物剂量依赖性实验,1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对Eca-109食管癌细胞在作用24、48、72 h时均具有抑制作用，且在有效抑制范围内，未达抑制峰值，作为实验药物浓度，便于调控(盐酸二甲双胍分子量约为165,1.50 mg/ml盐酸二甲双胍≈10 μmol/ml盐酸二甲双胍，二甲双胍主要在小肠内被人体吸收，口服二甲双胍后2 h即可达药物浓度峰值2 μg/ml，药物易积聚于肠壁，为血浆浓度的10～100倍，体外实验药物浓度需控制在体内用药的20倍以内，考虑含服盐酸二甲双胍可使食管癌细胞周围药物浓度增加)，因此可采用1.50 mg/ml盐酸二甲双胍作为后续实验的药物浓度)。另取一洁净的96孔板，检测1.50 mg/ml盐酸二甲双胍作用于Eca-109食管癌细胞24、48、72 h时的细胞增殖能力(MTT操作步骤同上)。③划痕实验观察细胞迁移能力：预先用洁净的记号笔在6孔板背面划横线，尽可能均匀、平直，约隔0.5～1.0 cm一道，横穿每孔底部，每孔至少有3条线穿过。将Eca-109食管癌细胞均匀地播种在预处理的6孔板中培养。待细胞密度达70%～80%时，用200 μl无菌枪头尽量垂直于6孔板底部的横线做划痕，PBS液或生理盐水洗去划下的细胞，在倒置显微镜下取笔直一段做观察并摄影，给予含有1.50 mg/ml盐酸二甲双胍的细胞培养液(设置为MET组)及单纯细胞培养液(设置为CK组)于37℃恒温、95%O2、5%CO2空气孵箱中培养，作用24、48 h时观察细胞于划痕处的细胞迁移、生长情况，用Image J及SPSS Statistic 17.0处理图像、数据，分析两组无细胞区域的面积占比及其平均值并判断其差异是否有统计学差异。用细胞迁移指数(Migration index，MI)表示细胞迁移的快慢。MI=100%(S0-St)/S0,St是指划痕后t h后测得的无细胞区域面积占比，S0是指划痕后即可测得的无细胞区域面积占比,St-S0是指t h到划痕初这段时间内无细胞区域占比变化值。④Western blotting观察盐酸二甲双胍对Eca-109食管癌细胞迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14、Glut1表达活性的影响：用含1.50 mg/ml的盐酸二甲双胍与单纯细胞培养液分别培养Eca-109食管癌细胞，48 h后用组织、细胞裂解液裂解细胞并提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液后于100℃下变性5 min。依次制备8%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转法转膜将蛋白转到硝酸纤维素膜(PVDF膜)上，常温下用封闭液(5%脱脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐温20、pH 7.5)封闭2 h以上，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐温20、pH 7.5)洗膜3次后，加入一抗并在4℃冰箱内过夜，次日TBST洗膜3次后加入二抗常温孵化2 h以上，TBST洗净二抗，加入显影剂在显影仪内显影，以β-Actin为内参蛋白，在内参平齐的前提下，观察并用Image J及SPSS Statistic 17.0处理蛋白条影、分析数据，评估MET、CK两组细胞迁移相关蛋白的表达水平。

结 果

1 盐酸二甲双胍对体外Eca-109食管癌细胞增殖能力的影响 含不同浓度盐酸二甲双胍的细胞培养液培养Eca-109食管癌细胞48 h后，随着药物浓度的增高，96孔板各孔的OD值逐渐降低(图1)。

图1 不同浓度盐酸二甲双胍作用于体外

用含1.50 mg/ml盐酸二甲双胍的细胞培养液(MET组)与不含盐酸二甲双胍的细胞培养液(CK组)培养Eca-109食管癌细胞24、48、72 h，MET组的OD值均小于CK组(图2)，见表1；相对增殖能力也随盐酸二甲双胍作用时间的延长而递减(细胞相对增殖能力=100%×某时刻实验组细胞增殖能力/同时刻对照组细胞增殖能力)(图2)。

2 1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对体外Eca-109食管癌细胞迁移能力的影响 划痕后24 h，MET组无细胞区域面积占比明显高于CK组；而划痕后0、48 h，MET组及CK组无细胞区域面积占比无统计学差异(图3)，见表2；细胞迁移指数(MI)也表现为划痕后24 h，MET组小于CK组，48 h时两组无统计学差异，细胞迁移指数(MI)均为1，表现为48 h时两组细胞划痕处均已愈合(图3)，见表3。

3 1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对体外Eca-109食管癌细胞迁移能力相关蛋白MMP-2、MMP-9及GLUT1、MMP-14的影响 含1.5 mg/ml盐酸二甲双胍的细胞培养液体外培养Eca-109食管癌细胞48 h后，MET组迁移相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达量分别是(0.4026±0.2224)、(0.5009±0.2728),均明显少于CK组的(1.0309±0.0687)、(1.0167±0.0905),差异具有统计学意义(P<0.05)(图4)；蛋白GLUT1、MMP-14的表达量也表现为CK组的(1.1991±0.2134)、(1.0025±0.1179)高于MET组的(0.7751±0.3114)、(0.6495±0.2563),差异具有统计学意义(P<0.05)(图5)。

表1 1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对体外Eca-109食管癌细胞增殖能力的影响

图2 1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对Eca-109食管癌细胞增殖能力及相对增殖能力的影响

图3 1.50 mg/ml盐酸二甲双胍对体外Eca-109食管癌细胞迁移能力的影响(40×)

表2 划痕后0、24、48 h的无细胞区域面积占比(%Area)

表3 划痕后24、48 h的细胞迁移指数(MI)

讨 论

我国是食管癌高发地区，其发病率及死亡率均居世界首位，有研究指出，我国2011年新增食管癌患者近30万例，死亡人数约22万例，占据世界一半以上，我国食管癌发病率及病死率约占世界的64.7%及54.7%，2012年较2011年比例有所下降，其发病率、病死率约为50%、49%，但我国人口基数大,每年仍有很多患者承受食管癌病痛的折磨[6]。

注：MET组Eca-109食管癌细胞的MMP-2、MMP-9的表达量与CK组比较，#P<0.05

注：MET组Eca-109食管癌细胞的GLUT1、MMP-14的表达量与CK组比较，#P<0.05

二甲双胍(Metformin,MET)是重要的临床降血糖药物，具有良好的短期、长期降糖效果[7-10]。有研究表明，二甲双胍可使中国新诊断的2型糖尿病患者的 HbA1c水平降低1.8%(可能含安慰剂效应),并且不受体重的影响[11]。英国的一项病例对照研究资料表明，二甲双胍的使用与恶性肿瘤发生风险的下降具有一定相关性，二甲双胍使用时间的延长及使用次数的增加，可使恶性肿瘤的发病风险降低[12-13]，这可能通过促进细胞内脂类物质代谢、调节机体内分泌水平、抑制血小板亢进及降低血液高凝状态等途径，抑制肿瘤细胞的发生、发展[14]。通过该实验可明显发现，随着盐酸二甲双胍药物浓度的增高，Eca-109食管癌细胞的增殖能力表现为递减趋势；当给予含1.50 mg/ml盐酸二甲双胍的细胞培养基体外培养Eca-109食管癌细胞24、48、72 h时，其增殖能力均弱于对照组，并具有统计学差异；相对增殖能力也随时间的递增而递减，表明MET组Eca-109食管癌细胞增殖能力受抑制程度具有时间相关性。MTT实验结果说明盐酸二甲双胍可抑制Eca-109食管癌细胞的生长、增殖，降低Eca-109食管癌细胞的增殖能力，并表现为剂量及时间依赖性。

恶性肿瘤细胞具有高增殖能力、高迁移能力、分化程度低等特点，也是区别于正常细胞的重要特性。食管癌患者早期一般无特殊症状，当出现进行性吞咽困难、饮水呛咳、痰中带血或咯血等临床症状时，很大比例的患者已发生肿瘤细胞转移，可侵犯临近组织及器官，当食管癌侵犯气管时会引起患者长期刺激性咳嗽，侵犯声带时引起患者声嘶等。有临床研究表明，在糖尿病人群中，长期服用二甲双胍的患者，其恶性肿瘤发生率及转移率要低于非二甲双胍治疗人群，注射胰岛素治疗的患者，其肿瘤发生风险、转移率要高于非胰岛素治疗人群[15-16]。划痕实验是检验细胞迁移能力的重要实验之一，在实验中，MET组与CK组对比，划痕后24 h，MET组无细胞区域面积占比明显高于CK组，细胞迁移指数(MI)明显低于CK组，表明盐酸二甲双胍可抑制Eca-109食管癌细胞的迁移能力；迁移后48 h，两组的无细胞区域面积占比及细胞迁移指数(MI)均统计学差异，但CK组于划痕后24 h的无细胞区域面积占比低于MET组，不除外划痕24 h后CK组的迁移速度高于MET组；结合镜下观察及统计学分析结果，盐酸二甲双胍可抑制Eca-109食管癌细胞的迁移能力。

基质金属蛋白酶系(MMPs)是锌依赖性蛋白水解酶家族[17]，在正常组织细胞中，MMPs表达量极少。MMPs可以降解细胞外基质，引发细胞从组织中脱落，在肿瘤细胞中，MMPs的高表达，易使肿瘤细胞脱落，从而发生肿瘤转移；MMPs中的明胶酶 MMP-2、MMP-9在肿瘤细胞中表达量一般远高于正常细胞，这与肿瘤的浸润、转移有密切关系[18-20]。由Western blotting结果可见，经盐酸二甲双胍处理后的Eca-109食管癌细胞的MMP-2、MMP-9的表达量均少于CK组，联系划痕实验结果，提示盐酸二甲双胍可能通过降低MMP-2,、MMP-9的表达量抑制Eca-109食管癌细胞的迁移能力。MMP-14(膜型基质金属蛋白酶-1，MT1-MMP)同样具有消化细胞外基质作用，与此之外，MMP-14还参与多种细胞组织的病理生理过程，是最典型的膜型基质金属蛋白酶(MT1-MMP)[21],MMP-14主要存在于细胞膜上，可以激活部分明胶酶(如MMP-2、MMP-9)。人源葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)主要促进葡萄糖以扩散形式进入红细胞，也有转运葡萄糖入脑及其他组织供能等作用，有研究指出GLUT1会在恶性肿瘤细胞中呈高表达状态，可能是诱发肿瘤转移的中介物质，GLUT1与MMP-14关系密切，可激活MMP-14使其发挥生理功能[22]。盐酸二甲双胍处理后的Eca-109食管癌细胞的GLUT1、MMP-14表达量相对于CK组明显下降，提示盐酸二甲双胍降低Eca-109食管癌细胞迁移能力可能与抑制Eca-109食管癌细胞内的GLUT1、MMP-14表达量有关。

综上所述，盐酸二甲双胍可抑制体外Eca-109食管癌细胞的生长、增殖；并且可能通过抑制GLUT-1、MMP-14、MMP-2、MMP-9信号通路抑制体外Eca-109食管癌细胞的迁移能力。