葛根素-吡乙酰胺共晶的制备与表征

金 炀，陆 祥，蒋成君

(1.浙江科技学院 生物与化学工程学院，杭州 310023；2.桐庐县中医院，杭州 310028)

葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类化合物，能够扩张冠状动脉、增强心肌收缩力、保护心肌细胞、促进血液循环、降低血压、预防心律失常、抗血小板聚集及提高机体免疫力，对冠心病的治疗起到很好的作用[1-3]。然而，葛根素水溶性差，导致口服给药后生物利用度低，影响其药效，这成为制约葛根素制剂应用的瓶颈之一[4]。为解决葛根素水溶性差的问题，药学工作者尝试了很多方法，张焦等[5]采用纳米晶作为固体微粒稳定剂制备Pickering乳液，将水难溶性药物葛根素溶解于油相中；冯玉兰等[6]制备了葛根素PEG-PE纳米胶束。但是目前这些方法仍然存在一些问题，如Pickering乳液引入了甘油酯、油等油相组成，PEG-PE纳米胶束难以稳定等。因此，解决葛根素的溶解度低问题是当前药学工作者面临的难题。药物共晶无需改变活性药物分子的结构，通过共晶形成物修饰药物理化性质，这提供了一个改善难溶性有效成分溶解性的新方案[7]。张建军等[8]以咖啡因为共晶形成物，制备成难溶性药物槲皮素的共晶，共晶在50%乙醇水溶液中的溶解度为3.627 mg/mL，共晶溶解度相对于槲皮素提高了13.6倍。Sowa等[9]通过溶剂辅助碾磨法制备了漆黄素异烟酰胺、咖啡因和烟酰胺的共晶，在50∶50(V/V)乙醇-水溶液中研究其溶解度，漆黄素的溶解度为2.89 mg/mL，漆黄素异烟酰胺、漆黄素咖啡因、漆黄素烟酰胺的溶解度分别为4.43、5.29和7.43 mg/mL。共晶技术是提高黄酮类化合物溶解度的重要方法[10-11]，但目前鲜见对葛根素共晶的报道。黄酮类化合物易与酰胺类化合物形成共晶，因此，笔者对异烟酰胺、茶碱、吡乙酰胺这3种酰胺类化合物进行筛选，制备葛根素共晶，并对其溶解性进行研究。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

葛根素，纯度98%；吡乙酰胺，纯度99%；异烟酰胺，纯度98%，购于萨恩化学技术有限公司；碱纯度98%，购于梯希爱化成工业有限公司。差示扫描量热分析仪STA449F3，德国耐驰仪器公司；傅里叶红外光谱仪VERTEX 70，布鲁克科技有限公司；X射线衍射仪Ultima IV系列，日本津岛公司；扫描电子显微镜SU1510，日本日立高新技术公司；紫外可见分光光度计UV-5500，上海元析仪器有限公司。

1.2 葛根素共晶的制备

准确称取葛根素与异烟酰胺、茶碱、吡乙酰胺分别按摩尔比1∶1，1∶2，1∶3投料，置于烧杯中，在超声下用甲醇∶水=1∶1(V/V)的溶液将其溶解，室温条件下缓慢挥发溶剂，得到固体，过滤，减压干燥得到不同摩尔比组成的固体，待用。

1.3 X射线衍射分析

通过粉末X射线衍射来初步判断样品是否有可能是共晶。若有新的衍射峰生成则有可能是共晶。X射线衍射，射线源为Cu/Kα(λ=0.154 nm)，扫描范围为5°～40°(2θ)，扫描步长为0.05°，扫描速度为6°/min，电源设置为40 kV，40 mA。

1.4 差示扫描量热分析

以空白坩埚为参比，待测样品10 mg左右，在氮气保护的条件下进行测试，测试温度范围为50～250 ℃，升温速率为5 K/min。

1.5 傅里叶红外光谱分析

样品通过溴化钾压片的方式进行测定，扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.6 电子扫描显微镜分析

直接将样品粘在导电胶带上进行喷金，在5.0 kV电压下获得不同放大倍数的扫描电子显微镜照片。

1.7 葛根素共晶的溶解度测试

1.7.1 确定入射光波长的最大值λmax

称取0.037 9 g葛根素，在25 mL容量瓶中定容，得到质量浓度为1.516 mg/mL的葛根素标准溶液，以去离子水为基液，用紫外可见分光光度计的波长扫描功能对葛根素标准溶液进行波长扫描，得到最大吸收波长为331 nm。同理得到吡乙酰胺的最大吸收波长为192 nm，共晶的最大吸收波长为267 nm。

1.7.2 绘制标准曲线

称取0.1 g葛根素，在100 mL容量瓶中定容，得到质量浓度为1 mg/mL的溶液，再用规格为5 mL的移液枪精密吸取5 mL于50 mL容量瓶中定容，此时标准溶液质量浓度为100 μg/mL。取7支试管，精密配制一系列不同质量浓度的葛根素、制吡乙酰胺、共晶溶液，每种质量浓度再重复做3组，求平均值。以去离子水为空白，使用紫外可见分光光度计在波长331 nm处测定溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，以溶液的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.7.3 配制饱和溶液

分别称取若干葛根素、吡乙酰胺及共晶于烧杯中，加入适量去离子水，超声15 min后静置，直到有少量看得见的固体，否则就继续加入葛根素以达到饱和状态。过滤溶液，取滤液清液稀释若干倍，在选定的入射波长下测定吸光度，代入标准曲线中得到溶液质量浓度，从而得到溶质的溶解度。

2 结果与讨论

2.1 葛根素共晶的筛选

葛根素的结构中有6个羟基，存在与共晶形成物通过多种化学计量比形成共晶的可能。然而，如果共晶形成物与葛根素的摩尔比过大，容易导致共晶形成物单一物质的析出，不能形成共晶。筛选异烟酰胺、茶碱、吡乙酰胺，分别按摩尔比1∶1、1∶2、1∶3通过溶剂挥发结晶的方法得到不同比例组成固体，X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)分析如图1所示。

图1 不同比例组成固体的XRD图谱Fig.1 XRD pattern of samples with different proportions

由图1可知，只有当葛根素-吡乙酰胺以1∶2组成时，XRD图显示在15.9、19.6、21.05、23.35、26.2有新的特征峰出现，而原先葛根素中6.5、7.95、11.6、13.85的特征峰以及吡乙酰胺在6.4、14.45、17.5的特征峰均消失了，这符合共晶形成的标志。然而葛根素与吡乙酰胺都有氢键合成元结构，如图2所示，但两者以何种方式形成共晶有待进一步研究。

图2 葛根素与吡乙酰胺的化学结构式Fig.2 Chemical structure formula of puerarin and piracetamide

2.2 差示扫描量热分析

葛根素-吡乙酰胺共晶的粉末差示扫描量热(differential scanning calorimetry, DSC)分析结果如图3所示。

如图3所示，产物在163.78 ℃有一个吸热峰，不同于葛根素179.34 ℃以及吡乙酰胺158.15 ℃的熔点而是产生了一个新的熔点，这也进一步证明了有新的物质生成，这个新的吸热峰即共晶的熔点。

2.3 傅里叶红外光谱分析

图4所示为葛根素-吡乙酰胺共晶的傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared, FTIR)分析谱图。

图4 葛根素-吡乙酰胺共晶的FTIR图Fig.4 FTIR spectra of puerarin-piracetamide cocrystal

由图4可知，葛根素位于3 429 cm-1时的羟基—OH伸缩振动和位于1 635 cm-1的，羰基振动峰，以及吡乙酰胺位于3 450 cm-1的氨基—NH伸缩振动和位于1 690 cm-1的酰胺中羰基的振动峰，在葛根素-吡乙酰胺共晶中发生了偏移，分别到了3 398 cm-1和1 630 cm-1的较低波数。这是因为葛根素的羟基作为氢键的给体，吡乙酰胺中的羰基作为氢键的受体形成了氢键；也可能是葛根素的羰基为氢键的受体，吡乙酰胺中的氨基作为氢键的给体也形成了氢键。红外谱图显示形成共晶后，基团的特征吸收并没有消失，这可能与葛根素、吡乙酰胺有多个可以成氢键的基团有关。

2.4 扫描电子显微镜分析

将葛根素、吡乙酰胺晶体及葛根素-吡乙酰胺共晶进行扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)分析，结果如图5所示。

从扫描电镜中可以发现共晶与两个原料药的形态有明显的不同。葛根素粉末在放大2 000倍的条件下，形态为柱状；吡乙酰胺晶体在放大1 100倍的条件下，形态为棱柱状；葛根素-吡乙酰胺共晶在放大100倍的条件下，形态特性为片状。这进一步验证了共晶的形成。

图5 葛根素、吡乙酰胺及其共晶的扫描电镜图Fig.5 SEM of puerarin, piracetamide and their cocrystal

2.5 溶解度测试结果

葛根素、吡乙酰胺以及共晶的标准曲线如图6所示。

图6 葛根素、吡乙酰胺及其共晶的标准曲线Fig.6 Standard curves of puerarin, piracetamide and their cocrystal

由图6可知，葛根素、吡乙酰胺及共晶的吸光度与质量浓度之间呈线性关系，R2分别为0.998、0.993和0.993，适合用于溶解度分析。将制备得到的葛根素、吡乙酰胺及共晶的饱和溶液分别置于紫外可见分光光度计中测吸光度，测得的吸光度值分别为0.169 5、0.522 2、0.459 1，根据稀释倍数得到葛根素的溶解度为0.003 g/mL，吡乙酰胺的溶解度为0.532 g/mL，共晶的溶解度为0.062 g/mL，共晶的溶解度介于二者之间，是葛根素溶解度的20倍。

3 结 语

筛选异烟酰胺、茶碱、吡乙酰胺为共晶形成物，分别按摩尔比1∶1、1∶2、1∶3通过溶剂挥发结晶的方法得到不同比例组成的固体。将制备的样品进行XRD分析表征，当葛根素与吡乙酰胺以摩尔比1∶2组成得到的晶体在图谱上分别是15.9、19.6、21.05、23.35、26.2的特征峰，而葛根素中6.5、7.95、11.6、13.85的特征峰以及吡乙酰胺6.4、14.45、17.5的特征峰均消失了。采用DSC分析，结果表明，有新的熔点产生，共晶在163.78 ℃左右有一个吸热峰，不同于葛根素的179.34 ℃以及吡乙酰胺158.15 ℃的熔点，这也进一步证明了有新的物质生成。用傅里叶红外光谱分析葛根素-吡乙酰胺样品，出现了特征峰的偏移；用扫描电子显微镜分析葛根素、吡乙酰胺与葛根素-吡乙酰胺共晶形态，观察到表面形态有着较大的区别，进一步确定了葛根素和吡乙酰胺产生了共晶，共晶体的溶解度是葛根素溶解度的20倍。