云南地方品种子预44中一个新的抗稻瘟病基因的定位

卓晓轩 樊琳琳 安星宇 郭敬玮 杨睿 曾千春 罗琼



云南地方品种子预44中一个新的抗稻瘟病基因的定位

卓晓轩#樊琳琳#安星宇#郭敬玮 杨睿 曾千春 罗琼*

(云南农业大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室/云南农业大学 农业生物多样性与病虫害控制教育部重点实验室, 昆明 650201;#共同第一作者;*通讯联系人, E-mail: qiongbf@aliyun.com)

【目的】子预44是具有广谱持久稻瘟病抗性的云南地方粳稻品种。为了揭示子预44广谱持久抗瘟机制并在抗稻瘟病育种中进行有效利用，【方法】利用江南香糯与子预44杂交构建的遗传群体及分离自云南罗平的稻瘟病菌株LP36进行子预44的抗性遗传分析和抗性基因定位。【结果】子预44对LP36的抗性为单显性基因控制，暂定名为(t)，它位于水稻第4染色体长臂上SSR标记RM5503与RM3276之间约318 kb区间内。【结论】(t)为新的抗稻瘟病基因。研究结果为子预44的育种利用和(t)基因的克隆提供了重要信息。

水稻；稻瘟病；抗稻瘟病基因；基因定位

由稻瘟病菌（）引起的稻瘟病是水稻最具毁灭性的病害之一，分布范围极广，严重威胁世界粮食安全，全球每年因稻瘟病造成的粮食损失足以养活6千万人口[1]。国内外对稻瘟病的防治进行了大量调查和广泛深入的研究，取得了可喜的成绩和巨大进步[2]。目前，稻瘟病的防治措施主要包括抗病品种选育、化学防治和栽培管理，而利用水稻自身的抗病基因培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的方法[3]。由于水稻基因组学研究的快速发展，2006年以后，鉴定和克隆的抗稻瘟病基因大量增加。迄今为止，水稻中报道的主效抗稻瘟病基因已超过100个[4]，已经克隆的基因有26个，包括[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[17]、[18]、[3]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]和[28]。这些基因分别属于核苷酸结合位点和富含亮氨酸的重复序列(nucleotide-binding site and leucine-rich repeats，NBS-LRR)家族、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Serine/ Threonine specific Protein Kinase，STK)家族、脯氨酸富含蛋白、C2H2类转录因子家族，主要分布在水稻第1、6和11染色体上。相比籼稻，粳稻稻瘟病抗性普遍较弱，抗性资源缺乏[9]，目前克隆的抗稻瘟病基因主要来自籼稻抗性资源。

子预44是云南地方品种麻早谷与城堡2号杂交选育而成的高原粳稻。张锦文等[29]于2004－2007年在云南宜良稻瘟病高发区进行了子预44稻瘟病抗谱鉴定。子预44对6群16个稻瘟病菌生理小种(ZA1、ZA49、ZA57、ZA61、ZB1、ZB13、ZB17、ZB25、ZC1、ZC3、ZC13、ZC15、ZE1、ZE3、ZF1和ZG1)表现抗性；2012年，我们在宜良稻瘟病高发区对子预44进行苗期自然接种加诱发接种(将上年采集于宜良发病田块的感病秸秆与当年发病田块的新鲜稻瘟病植株形成的天然混合菌株撒盖在3~4叶期幼苗上)进行田间抗性鉴定，子预44仍表现高抗稻瘟病[30]。此外，在稻瘟病严重发生的江苏扬州(2014年)、海南陵水(2015年)、云南罗平和湖北恩施(2017年)，子预44均表现高抗稻瘟病(未发表资料)。子预44为深入研究粳稻的广谱持久稻瘟病抗性分子遗传机制带来了契机。

我们在子预44中鉴定了抗不同稻瘟病菌株的主效基因(t)[31]、(t)[32]、(t)[33]和微效基因[34]。本研究利用感病品种江南香糯与子预44杂交构建的F2群体，鉴定了一个位于水稻第4染色体长臂上、抗稻瘟病菌株LP36的抗稻瘟病基因。这也是在第4染色体上定位的第一个抗瘟主效基因。这为进一步克隆该基因奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 水稻材料和菌株

水稻材料包括子预44、江南香糯、日本晴以及用于抗性遗传分析和基因定位的子预44/江南香糯F2群体。稻瘟病菌株LP36由云南农业大学何月秋教授课题组提供。

1.2 水稻幼苗培育

挑选发育良好、饱满无病的子预44，江南香糯及江南香糯与子预44杂交获得的F2代种子，用75%的酒精消毒2 min，再用20%的次氯酸钠消毒40 min，清水漂洗后，水中浸泡24 h，让种子充分吸涨，然后放入37℃恒温箱中催芽。将萌发的种子放入96孔育苗盘，用清水养至其根长约10 cm，再换成营养液培养，3~4叶期幼苗用于接种。

1.3 稻瘟病菌孢子悬浮液制备及接种鉴定

将滤纸片保存的菌株置于马铃薯葡萄糖固体培养基(马铃薯200 g/L煮烂，两层纱布过滤，葡萄糖20 g/L，琼脂13 g/L)上，28℃活化培养3~4 d，待菌落长出后，挑少量菌丝块置于马铃薯葡萄糖液体培养基(马铃薯200 g/L煮烂，两层纱布过滤，葡萄糖20 g/L)上，于恒温摇床上(28℃、180 r/min)培养3 d，吸取800 µL菌液至番茄燕麦培养基(番茄汁200 mL/L，燕麦40 g/L，燕麦加水煮烂，两层纱布过滤，残渣捣碎机打细过滤，淀粉18 g/L，琼脂粉18 g/L)上，用涂布棒将菌液均匀涂于培养基表面，28℃下光照培养4 d，用无菌水洗下孢子，滤布(Miracloth神奇滤布475855)过滤，将菌液的孢子浓度调至2×105个/mL，加入4‰明胶配成孢子悬浮液。

孢子悬浮液喷雾接种3~4叶期的水稻幼苗。接种后的水稻幼苗在28℃、湿度90%的培养箱内黑暗培育24 h。24 h后保持温度和湿度不变，12 h光照/12 h黑暗培养5~7 d后进行表型鉴定和抗性评价。

Z−子预44；J−江南香糯；N−日本晴。

Fig. 1. Phenotypes of Ziyu 44, Jiangnanxiangnuo and Nipponbare inoculated with.isolate LP36.

1.4 基因组DNA提取及PCR扩增

基因组DNA提取采用CTAB法。PCR体系(20 µL) 包含DNA模板(10 ng/µL) 2 µL，前后引物(10 ng/µL) 各0.5 µL, 10×缓冲液2.5 µL，dNTPs 2 µL，酶0.4 µL，加ddH2O补足至20 μL。PCR程序如下：94℃下预变性5 min，94℃下变性30 s，58℃下(或参考引物序列适当改变温度)退火30 s，72℃下延伸30 s(根据产物大小适当改变时间)，34个循环；72℃下延伸7 min。PCR产物用4%琼脂糖凝胶进行电泳，紫外照胶仪(SmartGel II)进行拍照记录。

1.5 定位区间内候选基因的鉴定

根据水稻基因组注释项目(Rice Genome Annotation Project, http://rice.plantbiology.msu.edu/ index. shtml)的基因预测和功能注释结果对定位区间内候选基因进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 子预44对稻瘟病菌株LP36的抗性鉴定及遗传分析

稻瘟病菌株LP36喷雾接种子预44、江南香糯和日本晴3~4叶期幼苗，5~7 d后进行抗性鉴定。子预44表现为高抗稻瘟病菌株LP36，江南香糯和日本晴高感(图1)。

进一步利用LP36菌株对子预44、江南香糯及子预44与江南香糯杂交获得的F2群体进行喷雾接种和抗性评价。F2代群体抗感性状分离明显（图2），149株F2群体中鉴定出明显感病的单株33株，抗、感性状分离符合3∶1的分离比（χc2﹤χ20.05,1=3.84,表1），即子预44对稻瘟病菌株LP36的抗性属于单基因控制的显性遗传。将该基因暂定名为(t)。

Z−子预44；J−江南香糯；R−F2群体抗病单株；S−F2群体感病单株。

Fig. 2. Phenotypes of parents and F2plants inoculated with.isolate LP36.

2.2 Pi-zy4(t)的精细定位

采用CTAB法分单株提取全部感病单株及部分抗病单株基因组DNA。每条染色体上选取2对（长短臂各一对）在亲本子预44、江南香糯间呈现较好多态性的SSR引物，先对10个感病单株和10个抗病单株进行性状连锁分析。发现位于第4染色体长臂上的SSR标记RM5503（物理位置30.76 Mb）与抗感性状存在明显的连锁关系。通过子预44和江南香糯两亲本间多态性的引物进行连锁分析，初步把(t)定位于水稻第4染色体长臂上（图3）。

进一步用稻瘟病菌株LP36接种317个单株组成的F2群体，又鉴定出了明显感病的单株105株，共得到138株感病单株。根据初步定位的结果，我们对位于水稻第4染色体长臂上RM5503附近的SSR标记进行亲本子预44和江南香糯间多态性分析(包括RM5503)，获得揭示两亲本间多态性的引物有25对。用这25对多态性SSR引物对F2群体中鉴定出的138个感病单株进行连锁分析，发现SSR标记RM3276(物理位置31.08 Mb)和SSR标记RM5503(物理位置30.76 Mb)与感病性状紧密连锁，分别有一个交换单株；SSR标记RM17450(物理位置30.88 Mb)与感病性状共分离(图3~4)。为此，(t)被定位于水稻第4染色体长臂上SSR标记RM5503与RM3276之间约318 kb的范围内。

表1 江南香糯×子预44的F2群体对LP36的抗性分离情况

图3 Pi-zy4(t)的精细定位

Fig. 3. Fine mapping of the(t) locus.

2.3 定位区间候选基因的预测

水稻第4染色体长臂上报道了2个数量抗性位点基因，一个是隐性抗稻瘟病基因(物理位置19.66 Mb)[23]；另一个是显性抗稻瘟病基因(物理位置31.55 Mb)[27]，与主效抗病基因(t)(物理位置30.76−31.08 Mb)所在位置不同，表明(t)是一新的抗稻瘟病基因。

(t)的定位区间注释有40个基因(表2)，这40个基因包含有表达蛋白、转移酶家族结构域蛋白、萜类合酶、蛋白激酶等。其中，3个预测的基因属于已知的抗病基因类型，包括LOC_Os04g51880(编码GHMP激酶ATP结合蛋白)、LOC_Os04g51950(编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶HT1)和LOC_ Os04g52140(编码包含蛋白激酶结构域的蛋白)。

3 讨论

植物在生长发育过程中，会受到真菌、细菌、病毒、线虫等病原物的侵袭，表现为抗病或感病，在长期的相互作用、相互选择、协同进化的过程中，植物逐渐形成了一系列复杂的防御机制来保护自己。Flor[35]的基因对基因假说认为在寄主中控制抗病性或感病性的基因与在病原菌中控制无毒性或毒性的基因相互对应。这一假说为现在克隆病原菌无毒基因和植物抗病基因，研究植物抗病机制并将其运用于育种，培育高抗植株提供了理论基础。

基于Flor的基因对基因假说已克隆的植物抗病基因大致可分为11种类型：第一类编码胞内的丝苏氨酸激酶(STK)基因，如番茄的基因[36]；第二类编码类受体激酶基因，如水稻抗白叶枯基因[34]；第三类编码N端富含亮氨酸重复(LRR)的跨膜受体蛋白(LRR-TM)基因，如番茄的基因[37]；第四类编码毒素还原酶类抗病基因，如玉米抗病基因[38]；第五类编码类似细胞表面受体(CSLR)蛋白结构的基因，如番茄中的基因[39]；第六类编码热激蛋白基因，如拟南芥的抗烟草花叶病毒基因和[40]；第七类编码膜锚定蛋白的基因，含有7个跨膜蛋白螺旋(TM)，如大麦抗白粉病基因[41]；第八类编码未知蛋白基因，如水稻抗白叶枯病基因[42]；第九类编码脯氨酸富含蛋白，如水稻抗稻瘟病基因[21]；第十类C2H2类转录因子类型，如水稻基因[28]；第十一类编码NBS-LRR类抗病基因，这一类家族基因又分为2个亚类：TIR-NBS-LRR，如拟南芥[43]；non- NBS-LRR，如水稻中的基因[7]。水稻中已克隆的26个抗稻瘟病基因除属于STK结构域，属于脯氨酸富含蛋白，属于C2H2类转录因子类型外，其余23个基因均属于NBS-LRR结构类型。

Z−子预44；J−江南香糯；1~22−F2感病单株。

Fig. 4.Segregation of RM5503, RM17450 and RM3276 in F2population.

表2 第4染色体长臂上候选区间内注释的40个基因

(t)定位区间注释的40个基因中，6个基因LOC_Os04g51880、LOC_Os04g51950、LOC_ Os04g52030、LOC_Os04g52090、LOC_Os04g52120和LOC_Os04g52140可作为我们进一步研究的首选候选基因。LOC_Os04g51880编码GHMP激酶ATP结合蛋白，GHMP基因家族成员参与逆境胁迫信号传导途径[44]；LOC_Os04g51950编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶HT1；LOC_Os04g52030编码锌指结构域，属于LSD1亚家族蛋白，LSD1亚家族蛋白与植物免疫反应中的过敏反应相关，作为植物程序性细胞死亡的负调控因子[45]；LOC_Os04g52090编码AP2结构域蛋白，参与植物生长、发育以及多种生理生化反应的信号传导，如花器官形成、抗病、抗逆、激素响应(乙烯等)[46]；LOC_Os04g52120编码钾转运蛋白，参与植物抗逆反应代谢过程[47]；LOC_ Os04g52140编码包含激酶结构域的蛋白。LOC_ Os04g52030，LOC_Os04g52090和LOC_Os04g 52120编码蛋白结构与目前报道的已克隆的植物抗病基因结构均不相同。(t)基因的克隆和功能研究也许会带来植物防卫反应新机制的发现。

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Mapping of a New Rice Blast Resistance Gene in Ziyu 44, a Rice Landrace from Yunnan Province, China

ZHUO Xiaoxuan#, FAN Linlin#, AN Xingyu#, GUO Jingwei, YANG Rui, ZENG Qianchun, LUO Qiong*

(,)

【Objective】Ziyu 44 (L. subsp.), a landrace of Yunnan Province, has broad-spectrum and durable blast resistance. In order to understand the molecular mechanism of resistance to rice blast, 【Method】we carried out the genetic analysis of resistance of Ziyu 44 to theLP36 from Luoping County, Yunnan Province, and mapped the gene responsible for resistance to strain LP36 by using an F2population from the cross between Jiangnanxiangnuo and Ziyu 44.【Result】The resistance of Ziyu 44 to LP36 is controlled by a single dominant gene, termed as(t), which was located on the long arm of chromosome 4 between simple sequence repeat markers RM5503 and RM3276 within about 318 kb.【Conclusion】(t) is a new gene conferring resistance to rice blast. Our results provide essential information for further utilization of the blast resistance gene in rice breeding and its cloning.

rice; rice blast; blast resistance gene; gene mapping

10.16819/j.1001-7216.2019.8054

S435.111.4+1

A

1001-7216(2019)01-0012-08

2018-04-28；

2018-06-20。

国家重点研发计划资助项目(2016YFD0100601)；国家自然科学基金资助项目(31160223)；云南省高校科技创新团队支持计划资助(IRTSTYN)。