SNHG11 通过激活 Wnt 信号通路促进骨肉瘤细胞增殖

王辉 马明亮 张德刚 张锴 贾龙 刘栋 杜刚强 李朋 吴虹

骨肉瘤 ( osteosarcoma，OS ) 是青少年中最常见的恶性肿瘤之一。随着治疗手段的不断更新，治疗技术的不断进步，骨肉瘤 5 年生存率有提高，但是仍仅有 50% 左右[1-2]。由于骨肉瘤发生、发展的分子机制尚未完全阐明，缺乏有效的分子治疗靶点，导致缺少有效的治疗药物。因此，继续寻找骨肉瘤中发挥重要作用的分子，寻找针对这些重要分子的药物，对提高骨肉瘤患者预后有着重要作用。

长链非编码 RNA 是一种长度超过 200bp 的不能编码蛋白的 RNA。近年来研究证明长链非编码 RNA( long non-coding RNA，lncRNA ) 在肿瘤中发挥重要作用，例如：SNHG6-003 ( small nucleolar RNA host gene 6 )、lincRNA-UFC1 ( long intergenic noncoding RNA UFC1 ) 在肝癌增殖中发挥重要作用[3-4]。而且，研究也表明，lncRNA 在骨肉瘤中也发挥举足轻重的作用，例如：lncRNA-ANCR 可通过下调 EZH2的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。而笔者也发现 SNHG11 ( small nucleolar RNA host gene 11 ) 在骨肉瘤中高表达，通过本研究笔者继续探讨SNHG11 在骨肉瘤中的生物学作用及机制。

材料与方法

一、纳入与排除标准

1. 纳入标准：( 1 ) 2015 年 1 月至 2016 年 12 月期间接受手术治疗的骨肉瘤者；( 2 ) 术前未经任何治疗者；( 3 ) 术后病理提示骨肉瘤者。

2. 排除标准：( 1 ) 术前经受过放化疗等手术外其它治疗方式者；( 2 ) 术后病理提示非骨肉瘤者。

本研究共纳入 10 例。男 7 例，女 3 例，年龄( 20～45 ) 岁，平均 ( 25.42±6.35 ) 岁。肿瘤组织及癌旁组织离体后保存于液氮中，本研究所有受试者均签署知情同意书，并且本研究已通过医院伦理委员会的批准。

二、实验方法

1. 细胞及材料：细胞培养：U-2 OS 购买于上海细胞库，10% 胎牛血清的 DMEM 培养液，于 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。试剂：Wnt 信号通路抑制剂 XAV-939 购买于凯基公司，CCK-8 试剂盒购买于上海翊圣生物科技有限公司。

2. siRNA 的合成及转染：siRNA 由上海吉玛公司设计并合成。SNHG11 siRNA-1 sense：5'-GCTGGTTCCGCACCAGCCATT-3' siRNA-2sense：5'-ATGTTGGGAACATGCTAGATT-3' 取对数生长期状态良好细胞，将 2×105细胞接种于 6 孔板中，细胞密度达到 70% 左右用于转染。根据 Invitrogen 公司 LipofectamineTM2000 说明书操作。将 200pmol 待转染 siRNA 加入 250 μl OPTI-MEM 中，轻柔混匀待用。将 10 μl 脂质体加入 250 μl OPTI-MEM 中，轻柔混匀。将前两步所得试剂轻柔混匀，室温静置孵育20 min。将混合后的转染试剂直接加入细胞培养孔混匀，8 h 后更换培养基。

3. qRT-PCR 检测 mRNA 表达水平：根据 TAKARA 试剂盒说明书操作。引物采用 Primer Premier5.0软件设计。

SNHG11 上下游引物序列：上游引物：5'-GGTGCTGTGTACCTCCTCC-3'；下游引物：5'-CAGATCAGGGTGCTGCAGG-3'；β-actin：上游引物：5'-GCAGAAGGAGATCA-CAGCCCT-3'；下游引物：5'-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3'，均由上海生物工程技术有限公司合成。所有样本均重复检测 3 次，计算出 Ct 值，表达量采用 2-△△Ct法进行计算分析。

△Ct＝目的基因平均 Ct 值-内参基因平均Ct 值；

△△Ct＝实验组 △Ct-对照组 △Ct。

4. CCK-8 检测细胞增殖能力：将细胞接种至96 孔板，培养 24 h 后，向每孔中加入 10 微升 CCK溶液，孵育 4 h，用酶标仪测定在 450 纳米处的吸光度。

5. 流式细胞术检测细胞周期：采用凯基公司试剂盒，按其操作说明书操作，取对数生长期的细胞，完成相关处理后，培养 48 h 后，收集细胞，PBS 洗涤 2 次，用 75% 的乙醇固定细胞，24 h 后，去除乙醇，PBS 洗涤后，加入 PI 避光孵育，30 min后用流式细胞仪分析。

6. Western blot 检测蛋白表达水平：将贴壁细胞用 PBS 洗涤 2 次，采用 RIPA 试剂盒提取细胞总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度。10% SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后 BSA 封闭，然后用蛋白一抗稀释液孵育，4 ℃ 过夜。PBS 洗涤 2 次，二抗稀释液室温孵育 1 h。ECL 发光液发光，X 线底片曝光。

三、统计学处理

所有数据均应用 SPSS 17.0 统计软件分析，qRT-PCR 结果应用配对t检验，CCK-8 实验应用重复测量方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、SNHG11 在骨肉瘤中高表达

笔者利用 qRT-PCR 的方法检测了 10 对骨肉瘤及其癌旁组织中 SNHG11 的表达，结果提示：SNHG11 在肉瘤组织中高表达 ( 图 1 )。

二、SNHG11 通过诱导细胞周期进展促进骨肉瘤细胞的增殖

首先，笔者将 SNHG11 的 siRNA 转染至 U-2 OS 细胞，CCK-8 检测细胞增殖能力的变化，结果发现 U-2 OS 细胞增殖能力下降 ( 图 2，表 1 )，而将 SNHG11 慢病毒质粒转染至 U-2 OS 细胞，细胞增殖能力上升，提示 SNHG11 促进骨肉瘤细胞的增殖 ( 图 2，表 2 )。然后，笔者利用将 U-2 OS 细胞中的 SNHG11 沉默或过表达，利用流式细胞术检测细胞周期变化，发现沉默 U-2 OS 细胞中 SNHG11 的表达，细胞 G1 期比例增加，S 期比例下降，而过表达U-2 OS 细胞中 SNHG11，结果相反 ( 图 3 )。以上结果提示：SNHG11 通过诱导细胞周期进展促进骨肉瘤细胞的增殖。

图 1 qRT-PCR 检测 SNHG11 在骨肉瘤组织及其癌旁组织中的表达水平Fig.1 SNHG11 expression level in OS tissues by qRT-PCR

三、SNHG11 激活骨肉瘤细胞中 Wnt 信号通路

将 U-2 OS 细胞中的 SNHG11 沉默表达，发现Wnt 信号通路中 AXIN1 蛋白表达上调，而 β-catenin及其下游蛋白 c-myc、cyclinD1 表达下调，而在 U-2 OS 细胞过表达 SNHG11，结果相反 ( 图 4a )。之后笔者在 U-2 OS 细胞中过表达 SNHG11，细胞增殖能力增加，而在细胞中过表达 SNHG11 然后在用 Wnt信号通路抑制剂 XAV-939 处理细胞，SNHG11 促进U-2 OS 细胞增殖能力不明显 ( 图 4b )，提示 SNHG11通过激活 Wnt 细胞通路促进骨肉瘤细胞增殖。

图 2 SNHG11 促进骨肉瘤细胞的增殖 a：qRT-PCR 验证 SNHG11 的干扰及过表达效率；b：沉默或过表达 SNHG11，CCK-8 实验检测骨肉瘤细胞增殖能力 ( **表示 P ＜ 0.01 )Fig.2 SNHG11 promoted OS cell proliferation a: SNHG11 expressions were detected by qRT-PCR; b: CCK-8 was used to evaluate proliferation ability of OS cells after SNHG11 down- or over-expression ( ** P ＜ 0.01 )

图 3 SNHG11 诱导骨肉瘤细胞周期进展 a：在骨肉瘤细胞中沉默 SNHG11 的表达，流式细胞术检测细胞周期变化；b：在骨肉瘤细胞中过表达 SNHG11，流式细胞术检测细胞周期变化；c：对图 a、b 统计分析 ( *表示 P ＜ 0.05 )Fig.3 SNHG11 induced cell cycle progression a: Flow Cytometry analyzed OS cell cycle changes after SNHG11 downexpression; b: Flow Cytometry analyzed OS cell cycle changes after SNHG11 overexpression; c: Statistics for a and b ( * P ＜ 0.05 )

表 1 SNHG11 沉默表达后 U-2 OS 细胞增殖能力的变化Tab.1 Proliferation of U-2 OS cells after SNHG11 siRNAs transfected

表 2 SNHG11 过沉默表达后 U-2 OS 细胞增殖能力的变化Tab.2 Proliferation of U-2 OS cells after SNHG11 overexpression

图 4 SNHG11 激活 Wnt 信号通路 a：沉默或过表达 SNHG11，western blot 检测 Wnt 信号通路相关蛋白表达；b：过表达 SNHG11 或用 Wnt抑制剂处理细胞，CCK-8 实验检测骨肉瘤细胞增殖能力变化Fig.4 SNHG11 activated wnt pathway a: Western bot analyzed key protein expression level in wnt pathway after SNHG11 down- or over-expression;b: CCK-8 evaluated OS cell proliferation after XAV-939 was applied to manage SNHG11 overexpression

讨 论

近年来，lncRNA 在肿瘤中的作用逐渐被发现，越来越多的研究证明 lncRNA 可以调控肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、肿瘤细胞代谢等[5-7]。例如：lncRNA ANRIL 可以通过激活骨肉瘤细胞中 PI3K / AKT 信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖[8]，因此 lncRNA 在骨肉瘤进展过程中发挥非常重要的作用。

本研究，笔者证明 lncRNA SNHG11 在骨肉瘤组织中高表达，而且其可以促进骨肉瘤细胞的增殖，提示其具有促进骨肉瘤进展的作用。目前尚无关于SNHG11 在肿瘤中相关作用的报道，本研究首次证明了 SNHG11 在骨肉瘤进展过程中发挥举足轻重的作用。

Wnt 信号通路的激活已经被证明可以促进多种肿瘤中包括骨肉瘤的增殖、侵袭转移，因此有学者提出抑制 Wnt 信号通路的活性可能能够达到控制肿瘤的目的[9-10]。笔者的研究证明 SNHG11 可以通过激活 Wnt 信号通路促进骨肉瘤的进展。这为 Wnt 信号通路的调控机制提供了新的内容。

总之，通过本研究笔者证明了 SNHG11 在骨肉瘤中发挥癌基因的作用，下调 SNHG11 的表达可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，并且 SNHG11 可以通过激活 Wnt 信号通路促进骨肉瘤细胞的增殖。