TLR4 通路与激素性股骨头坏死关系的研究进展

朱道宇 杨前昊 高悠水 张长青

股骨头坏死 ( osteonecrosis of the femoral head，ONFH )病因多样，常导致股骨头血液供应破坏而引起软骨下骨变性、坏死，继而造成股骨头塌陷，最终发展为严重的骨性关节炎，是青壮年髋关节置换最常见的原因[1]。其中大量使用糖皮质激素最为多见，占 ONFH 的 45.6%[2-3]。研究发现，ONFH 与激素使用的最大剂量和累计剂量都有密切关系[3]。目前针对激素性 ONFH 的发病机制有多种假说，包括脂肪代谢紊乱、骨内高压、骨髓间充质干细胞( mesenchymal stem cells，MSCs ) 分化障碍、血液内凝血、二次碰撞等[4-5]，但均未能完全阐明。其中炎症是激素性ONFH 发生发展的重要促进因素之一。激素可以激活经典的 TLR4 炎症信号转导通路，促使核因子 κB ( nuclear factor κB，NF-κB ) 入核，释放大量炎症因子，如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等[6-8]，并抑制 MSCs 成骨分化及钙盐沉积，促进破骨细胞成熟，破坏血管稳态，最终导致 ONFH[9]。

一、TLR4 / NF-κB 通路生物学概况

研究证实，炎症及炎症因子在肿瘤、自身免疫性疾病和退行性疾病等重大疾病中发挥了至关重要的作用，与疾病的发生、发展及预后密切相关[10]。在骨形成和血管形成体系中，Toll 样受体 ( toll-like receptors，TLRs ) 介导的炎症反应发挥了核心作用。TLRs 是一类模式识别受体，能够特异性识别病原微生物进化中保守的抗原分子——病原相关分子模式 ( pathogen associated molecular patterns，PAMPs )[11]。它所介导的炎症反应是人体应对病原微生物和危险信号产生免疫应答的主要方式[12]。TLRs 的激活是一把双刃剑，它可以通过刺激先天性免疫应答和加强获得性免疫反应来保护机体，但是它所引起的持续性炎症反应也会对机体产生损伤。目前发现的 TLRs 家族至少包括12 个成员，不同的 TLRs 的配体也有所不同。其中 TLR4是介导内毒素 / 脂多糖 ( lipopolysaccharide，LPS ) 应答的最主要受体[13]。

TLR4 是 TLRs 家族的重要成员，也是人类发现的第一个 TLRs 相关蛋白。TLR4 的结构分为胞外域、跨膜域和胞内域。胞外域为一段重复的亮氨酸序列，可介导 PAMPs的识别。胞内域是一段高度保守的序列，又称为 TIR 区域。当 TLR4 与相应配体结合后，信号转导到 TIR 区域，TIR 原有二聚结构改变，这种简单的结构重排将为激活下游信号转导通路提供平台[9,13]。根据信号转导中衔接蛋白的不同，TLR4 信号转导通路可分为 MyD88 依赖性或MyD88 非依赖性信号转导通路，继而使 NF-κB 复合物中的抑制成分 IκB 磷酸化而脱颗粒，引起 NF-κB 的持续活化。活化的 NF-κB 迁移至核内，与基因上的 κB 位点发生特异性结合，从而促进各种炎症因子的转录，产生级联炎症反应[14]。NF-κB 是炎症反应中主要的转录因子，可以同时调控成骨细胞和破骨细胞，在维持骨稳态中发挥着重要的作用。

二、TLR4 / NF-κB 通路是激素导致 ONFH 的重要途径

糖皮质激素是临床常用的免疫调节类药物，具有强烈的免疫抑制作用。然而近年研究发现，激素也可以发挥促炎作用。对激素作用后的免疫细胞进行基因谱分析证实，激素不仅可以抑制免疫应答相关基因的表达，同时也可以发挥免疫允许及免疫增强作用；对于同一种基因，在不同激活状态的细胞中，激素也可以发挥截然相反的作用[15]。Barber 等[16]给受试者静脉注射皮质醇，随后注射 LPS，与仅使用 LPS 对照的人群相比，血液中 TNF-α、IL-6 和IL-12 的水平显著升高。糖皮质激素对 TLR4 通路同样呈双向调节作用。激素可通过与特异性受体的结合，经直接和间接的基因调控途径抑制 NF-κB[17]；而激素对 TLR4 通路的激活作用可能源于激素作用过程中产生的热休克蛋白90，热休克蛋白 90 是 TLR4 的配体之一，对 TLR4 有较强的激活作用[13]。此外有研究表明，低浓度的激素可以通过抑制 PI3K-Akt 通路，从而增加骨髓来源的单核细胞对LPS 的敏感性，促进 TLR4 / NF-κB 通路的激活[18]。

激素可以通过激活 Myd88 依赖性的 TLR4 / NF-κB 通路破坏骨稳态，抑制血管生成，引起 ONFH。坏死的骨组织可分泌肌腱蛋白和二聚糖，直接被 TLR4 识别，并进一步激活 Myd88 依赖性的 TLR4 / NF-κB 通路，而 Myd88非依赖性的 TLR4 / NF-κB 通路不被激活[19-21]。在敲除了 Myd88 的小鼠中坏死骨组织对 TLR4 无激活作用[22]。Adapala 等[21]证实在激素性 ONFH 模型中，TLR4 基因表达明显增多，而 TLR2 及 TLR9 没有明显改变。Tian 等[6]同样在激素性 ONFH 模型中发现 Myd88 依赖性的 NF-κB通路被激活，导致破骨细胞数量明显增多；而注射 TLR4的特异性拮抗剂 TAK242 后，ONFH 发生率显著降低。Okazaki 等采用肌注 LPS 和泼尼松的方法建立 Wistar 大鼠ONFH 模型，发现血清中的 IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，GM-CSF，IFN-γ 和 TNF-α 于第 1 周显著上升。这些炎症因子都是 TLR4 信号通路激活后的下游产物。进一步研究发现 ONFH 只在 LPS＋泼尼松组中出现，单用泼尼松并不会在大鼠中诱发 ONFH。研究者认为，LPS 和泼尼松诱导骨坏死与自身免疫系统失衡、脂质合成紊乱有关[23]。Pei 等[24]在激素性 ONFH 模型中发现，TLR4 可以通过抑制经典的 Wnt / β-catenin 通路从而抑制成骨，而加入 NF-κB 的抑制剂 PDTC 后，Wnt / β-catenin 通路上调，ONFH 的发生率明显下降。这些研究表明，经典的炎症通路 TLR4 / NF-κB 及相关炎症因子在激素性 ONFH 中扮演着重要角色[25]。

1. TLR4 / NF-κB 与骨形成：激素性 ONFH 的病理表现为骨小梁上弥漫性空泡状细胞，坏死骨组织被修复反应区所包绕，由此可见股骨头的自身修复反应伴随着骨坏死的发生即已出现。Qi 等[26]发现在干细胞的成骨分化中，TLR3，TLR4 的激活均可增加 I 型胶原和骨钙素的表达，TLR4 的激活效果更显著。Raicevic 等[27]研究发现激活TLR4 信号通路可促进 MSCs 向成骨方向分化，促进钙盐沉积，增强 ALP 活性，并且对骨髓来源的 MSCs 效果更为明显。有研究者在小鼠中将 TLR4 基因全敲后构建颅骨缺损模型，发现与野生型小鼠相比，缺少 TLR4 基因的小鼠骨愈合明显减慢[28]。然而，另有许多研究表明 TLR4 信号转导通路对成骨可能有一定的抑制作用。Muthukuru 等[29]在比较 TLR2 和 TLR4 在成骨中的关系时发现，激活 TLR2可以显著促进成骨，而激活 TLR4 则明显促进炎症因子IL-1β 的分泌，对成骨无明显的促进作用；但加入 TLR4的拮抗剂 Pg1449 后则可明显促进成骨分化。骨形态发生蛋白-2 ( bone morphogenetic protein-2，BMP-2 ) 是已知的具有较强促进成骨细胞分化和骨生成能力的刺激因子，但研究发现，即使在 BMP-2 刺激后，TLR4 被激活仍可显著抑制成骨细胞分化，提示 TLR4 对成骨分化有极强的抑制作用[30]。这些相互矛盾的结果说明 TLR4 对成骨作用的复杂性。

2. TLR4 / NF-κB 与血管生成：激素性 ONFH 主要是由于血供中断，局部缺血所引起的。血管能供给骨组织营养物质，因此血管生成是骨组织修复所必须的。TLR4 在血管形成和维持体系中也发挥了重要作用。Echavarria 等发现 LPS 可以激活内皮细胞的 TLR4 信号通路，将人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cells，HUVEC )暴露于 LPS 4～6 h，可诱导显著的炎症反应，白细胞黏附分子 ( VCAM1，ICAM1，E-SELECTIN ) 表达上调、细胞因子表达增加 ( TNF-α，IL-1β，IL6，IL8 )、NF-κB 活性增强[31]。TLR4 是炎症和血管再生的重要受体。对于炎症而言，以 LPS 为代表的配体与 TLR4 结合，可激活巨细胞，诱导产生大量的炎症因子，包括 ILs，TGF-β，IGF-1 等，这些炎症因子可以加强 VEGF 的功能。然而，很多诱导血管再生的因子也是炎症因子，缺血组织再灌注时，发生的微血管功能异常和炎症与这些炎症因子密切相关。因此，TLR4 既参与炎症，也参与血管化，它构成了一种内在的平衡。正常情况下不会造成组织损伤；异常情况时，若炎症细胞因子占优势，则组织损伤显著，若其占劣势，则血管化不足，缺血不能有效改善。

3. TLR4 / NF-κB 与骨吸收：在 ONFH 的病理过程中，破骨细胞活性增强，导致骨小梁吸收增多，也是股骨头发生塌陷的主要原因之一。田雷等[7]在激素性 ONFH 模型中发现 TLR4 通路被过度激活，可以引起免疫级联效应，使破骨细胞大量活化增殖，引起骨质疏松，导致股骨头抗压能力减弱。TLR4 通路被激活后，可诱导巨噬细胞中各种细胞因子和介质的产生，在破骨细胞祖细胞的发育成熟中发挥着重要作用。此外，TLR4 还可促进破骨细胞的融合和存活[32]。NF-κB 也可直接激活 MCP-1，诱导单核细胞 /巨噬细胞系分化，产生大量的破骨细胞。有研究表明大剂量激素可抑制破骨细胞的凋亡，延长其生存周期，促进骨吸收[33]。因此 TLR4 / NF-κB 成为许多新型药物的靶点。青藤碱可以通过抑制 TLR4 / TRAF6 的表达，抑制破骨细胞的分化与成熟，从而改善骨质疏松[34]；另一种新型的金刚烷类维甲酸 ST1926，可以抑制 NF-κB，进而抑制破骨细胞分化，改善被激素抑制的成骨基因表达及骨质疏松[35]。

三、炎症因子在 TLR4 影响 ONFH 中发挥着关键作用

TLR4 / NF-κB 通路被激活后可产生大量的炎症因子，如细胞因子 ( TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等 )、趋化因子、黏附分子、免疫识别受体及一些与炎症级联反应相关的酶，在骨吸收与骨再生中发挥着重要作用。一般来说，促炎因子可以通过上调 NF-κB 表达而抑制 MSCs 的成骨分化能力，而抗炎因子如 IL-10 和 IL-13 则起着相反的作用[36]。这些炎症因子与激素性 ONFH 的发生发展也有着密切联系[21,37-40]。其中，研究较多的炎症因子包括 TNF-α、IL-1β 和 IL-6。

TNF-α 在不同浓度时对成骨分化可以起到截然相反的作用。在低浓度时 TNF-α 可以剂量依赖性的促进 MSCs 成骨分化和基质矿化，对膜内成骨及软骨内成骨均有着重要的作用[41]。但在高浓度时 TNF-α 可以下调 Runx2 和骨钙蛋白的表达，抑制成骨细胞分化和骨形成，诱导成骨细胞的凋亡[42]。此外，TNF-α 对破骨细胞也有较强的激活作用。TNF-α 可促进破骨细胞前体细胞的增殖，诱导 NF-κB活化以激活破骨细胞核心因子 NFATc1，并能增加 OSCAR的表达以促进破骨细胞分化[43]。TNF-α 还可通过调控 Wnt信号通路影响破骨细胞的生成[35]。有研究显示在激素性ONFH 的早期 TNF-α 活性增强，可引起 M1 极化的巨噬细胞聚集，造成股骨头结构的破坏，而在 ONFH 晚期 TNF-α活性降低，引起 M2 极化的巨噬细胞聚集，可以起到修复损伤的作用[44]。激素性 ONFH 患者行人工全髋关节置换术前及术后血清中的 TNF-α 均显著高于正常人[45]；罗南萍等同样发现 SONFH 患者血清中的 TNF-α 显著高于正常人[46]；袁普卫等建立兔的激素性 ONFH 模型后，发现坏死组中兔血清的 TNF-α 浓度明显高于正常组，提示 TNF-α的水平升高与 ONFH 发生发展密切相关[47]。

IL-1β 对成骨的作用也较复杂。一方面 IL-1β 可以激活非经典的 Wnt-5a / Ror2 通路从而有效的促进 MSCs 成骨分化[48]，另一方面 IL-1β 又可以上调 Wnt 信号通路的拮抗剂 DKK1，从而抑制成骨基因的表达[49]。IL-1β 对破骨细胞也有较强的刺激作用，可以上调 RANKL 的表达。Adapala 等[21]构建了 Perthes 模型，发现修复区 CD14＋巨噬细胞数量明显增多，TNF-α、IL-1β 和 IL-6 表达均升高2～3 倍，伴随着 TLR4 通路的显著激活。值得注意的是，TLR4 通路在刺激 TNF-α 和 IL-1β 表达的同时，也可通过这些细胞因子进一步活化 NF-κB 造成持续的炎症反应。

IL-6 是成骨细胞和破骨细胞偶联的关键因子，在关节炎症与破坏中发挥着关键作用。间充质成骨系细胞分泌IL-6，通过接触依赖性方式促进破骨细胞生成，同时破骨细胞分泌 IL-6 以提高成骨细胞活性和促进新生骨形成。在青春期前期过度表达 IL-6 的小鼠表现出生长迟缓，胰岛素样生长因子 I 系统异常，生长板缺陷，骨化中心发育迟缓，成骨细胞和破骨细胞活性失调以及骨化不良[50]。临床研究发现，髋部骨折后下肢功能的恢复与血清 IL-6 水平呈负相关[51]。对 Perthes 病患者进行基因检测，发现在Perthes 患者中 IL-6 G-174C / G597A 基因多态性的杂合子受试者要明显低于对照组[52]，进一步研究表明 Perthes 患者中关节滑液里 IL-6 蛋白的表达显著增高，提示 IL-6 基因在 Perthes 病的发生发展中起着一定作用[53]。

其它的炎症因子研究较少，但对 ONFH 的产生也有一定作用。Tateda 等[54]研究发现激素可以抑制 NF-κB 的活性，但可通过激活 IRF7 的表达增加 IFN-α 的释放，进而引起 ONFH。另一种常见的炎症因子，IL-36 在骨坏死中的表达增高，并可通过激活 ERK 通路，抑制 TGF-β 介导的 COL1 的表达[55]。Zheng 等[56]收集了 125 例 ONFH 患者的血清，并与正常人进行比较后发现 IL-33 明显升高，同时 III / IV 期患者 IL-33 的浓度显著高于 I 收集期患者，提示 IL-33 可能对 ONFH 具有诊断意义，且与疾病的进展相关 ( 图 1 )。

四、展望

激素型 ONFH 是受多种因素共同调节介导的疾病，炎症反应在 ONFH 的发生发展过程中具有重要作用。对TLR4 信号通路与 ONFH 相关性进行深入研究，有助于解释 ONFH 发病机制及病理过程，并为 ONFH 的治疗提供新靶点和策略。目前，关于 TLR4 / NF-κB 通路参与 ONFH的具体机制仍不明确，研究多来源于动物实验或体外试验，有效性并不十分明确，针对通路中潜在治疗靶点的研究尚处于起步阶段，均有待更加深入的研究。

图 1 TLR4 信号通路作用机制Fig.1 The mechanism of TLR4 signaling pathway