辛伐他汀对2型糖尿病认知功能障碍的保护作用及其机制研究

张禾伟，房辉，孙雪玲，张雅中，田金莉

本文意义：

本文通过行为学检测及组织学观察，确定2型糖尿病大鼠认知功能障碍的存在，应用Western blotting证实雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）信号通路的激活和氧化应激相关蛋白的增多，并通过给予辛伐他汀改善2型糖尿病大鼠认知功能，抑制mTOR/p70S6K信号通路和氧化应激相关蛋白表达，为2型糖尿病认知损伤发生机制的研究提供新思路，为辛伐他汀在2型糖尿病患者中枢神经系统并发症中的临床应用提供理论依据。

糖尿病是目前患病率较高的慢性代谢性疾病之一。根据国际糖尿病联盟（IDF）统计，预计到2030年，中国糖尿病人群将增加至1.3亿［1］，其中大部分为2型糖尿病（T2DM）患者。T2DM除了可导致周围神经病变外，目前有研究表明T2DM可能对中枢神经系统（CNS）功能产生不利影响，其中认知功能障碍是最常见的症状［2］。MIJNHOUT等［3］提出了“糖尿病相关认知衰退（DACD）”一个新的术语，但糖尿病认知功能障碍的发病机制目前尚未十分明确，改善DACD的药物也亟待深入研究。有研究表明，辛伐他汀具有改善阿尔茨海默病（AD）患者认知功能的作用，潜在作用机制涉及多个方面［4-6］。认知功能障碍包括学习记忆能力、注意力、执行力下降，处理速度减慢和语言流畅度下降［7］。目前关于辛伐他汀对T2DM患者认知功能的作用及潜在机制的研究尚不多见，本实验通过观察辛伐他汀对T2DM大鼠学习记忆能力的影响，探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）/p70核糖体蛋白S6激酶（p70S6K）信号通路在辛伐他汀改善认知功能中的作用，旨在为临床T2DM认知功能障碍的诊断和治疗寻找新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠120只，8周龄，体质量（260±10）g，购自北京维通利华实验动物公司〔许可证号：SYXK（京）2017-0022〕，温度21～26 ℃，相对湿度40%～70%，饲养2周适应环境后用于实验。本研究经唐山市工人医院伦理委员会批准。

1.2 实验药品与试剂 链脲佐菌素（STZ）购自Sigma公司，辛伐他汀片（40 mg/片）购自美国默沙东公司，兔抗大鼠mTOR多克隆抗体（ab2732）、兔抗大鼠p70S6K多克隆抗体（ab32529）、兔抗大鼠tau多克隆抗体（ab32057）、兔抗大鼠丙二醛（MDA）多克隆抗体（ab194225）、兔抗大鼠谷胱甘肽（GSH）多克隆抗体（ab19534）、兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗体（ab177734）、兔抗大鼠p-p70S6K单克隆抗体（ab59208）、兔抗大鼠p-tau多克隆抗体（ab109390）均购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗（ZB-2306）购自北京中杉金桥生物技术有限公司，增强化学发光试剂（ECL）（PP2403）购自北京艾德莱生物科技有限公司，苏木素、伊红染液、Western转膜液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购自碧云天生物技术研究所。

1.3 仪器与设备 Morris水迷宫（上海欣软科技有限公司），FluorChen 5500凝胶成像分析系统（美国Thermo公司），BX-60型显微镜（日本Olympus公司），显微照相机（日本Olympus公司），Leica1512型石蜡切片机（德国Leitz公司），病理组织包埋机（德国LEICA公司），病理组织包埋冷冻台（德国LEICA公司），电泳转移槽（北京六一仪器厂），S-1000脱色摇床（其林贝尔仪器制造有限公司），SZ-93型自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂），AL204电子分析天平〔梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司〕，TGL-16G-A型低温离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 于2016年9月采用随机数字表法将120只健康雄性SD大鼠分为对照组（40只）、糖尿病组（40只）和辛伐他汀组（40只），各组自由进食水，糖尿病组和辛伐他汀组制备T2DM大鼠模型，高脂饲料饲养8周后，将STZ（40 mg/kg）溶解于0.1 mol/L枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液中，腹腔注射。72 h后，抽取鼠尾静脉血，采用罗氏血糖仪测定血糖。T2DM大鼠模型评价标准：血糖≥16.7 mmol/L为T2DM大鼠模型造模成功。对照组腹腔注射等体积枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液。糖尿病组、辛伐他汀组分别造模成功38、37只，造模成功后各组大鼠标准饲料饲养14周。

1.4.2 干预方法 造模成功后，将辛伐他汀溶于2 ml 0.9%氯化钠溶液，辛伐他汀组大鼠采用辛伐他汀灌胃（20 mg·kg-1·d-1），对照组和糖尿病组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液。干预后各组大鼠标准饲料饲养14周。

1.4.3 Morris水迷宫实验 大鼠进行Morris水迷宫实验，检测其空间学习和记忆能力。在直径为1.2 m的水池的南西（SW）象限内设置一个平台，作为目标象限，直径为10 cm，位于水面下1 cm。实验室的物品和人员位置在实验期间固定不变，作为空间参照物。第1天进行定位航行实验（place navigation），大鼠第1、4次从目标象限对侧的北东（NE）象限面朝池壁入水，第2、3次采用随机数表法选择象限（遇奇数时入东南象限，遇偶数时入西北象限）面朝池壁入水，测试4次/d，休息时间为10 min/次，监测时间为100 s，持续4 d，记录大鼠从入水到登岛成功的时间，即逃避潜伏期，大鼠在平台上停留＞2 s判为登岛成功，若大鼠100 s内未成功则记为100 s。训练后，用干毛巾将大鼠擦干，以防止低体温造成的应激。第5天进行空间搜索实验，拆除平台，大鼠在NE象限面朝池壁下水，观察并记录120 s内大鼠在SW象限内的停留时间，评估大鼠的记忆能力，停留时间越长，表示记忆能力越强。

1.4.4 超微病理检测 大鼠进行Morris水迷宫实验后，采用电子分析天平称量大鼠体质量，通过腹腔注射10%水合氯醛（4 ml/kg）深度麻醉大鼠（角膜反射消失），沿胸骨旁线剪开胸腹腔，充分暴露心脏、肝脏及主动脉，针头经左心室穿刺入升主动脉，剪开右心耳，以0.9%氯化钠溶液快速心脏灌注，至右心耳流出清亮液体，肝脏变白后，采用约250 ml的4%多聚甲醛溶液（pH为7.4）灌注至肢体僵硬，灌注速度先快后慢。待肢体充分固定后取两侧海马组织，一侧海马组织放入液氮速冻，-80 ℃保存；另一侧海马组织放入4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定24 h，将海马组织脱水，石蜡包埋，以2 μm连续切片，常规烤片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素、伊红染色，常规梯度乙醇脱水，中性树胶封固，于显微镜下观察各组大鼠海马结构的改变。

1.4.5 Western blotting 取出备用的海马组织，用预冷的眼科剪剪碎组织，冰浴中用匀浆器将组织匀浆，加入裂解液（每20 mg组织加入120 μl裂解液），4 ℃低温离心机，12 000 r/min离心15 min（离心半径为10 cm），取上清液，按每泳道50 μg总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳转移槽调为稳压状态，电压为80 V，使样品通过浓缩胶；当溴酚蓝入分离胶后，将电压调至120 V，继续电泳，至溴酚蓝达分离胶底部结束电泳。分离后转膜，浸入封闭液，室温孵育1.5 h。分别加入兔抗大鼠mTOR多克隆抗体（ab2732）（1∶1 000）、兔抗大鼠p70S6K多克隆抗体（ab32529）（1∶1 000）、兔抗大鼠tau多克隆抗体（ab32057）（1∶1 000）、兔抗大鼠MDA多克隆抗体（ab194225）（1∶1 000）、兔抗大鼠GSH多克隆抗体（ab19534）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-mTOR多克隆抗体（ab177734）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-p70S6K单克隆抗体（ab59208）（1∶1 000）、兔抗大鼠p-tau多克隆抗体（ab109390）（1∶1 000），4 ℃反应过夜，再加入HRP标记二抗（ZB-2306）工作液，室温避光缓慢摇90 min，ECL显色，曝光成像，重复3次。将实验结果用扫描仪进行扫描，在同一条件下，以β-actin为内参基因，采用ImageJ 1.41医学图像分析系统测定条带平均光密度（OD）值，进行比较。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以（±s）表示，多组间不同时间比较采用重复测量方差分析，同组不同时间及多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 3组大鼠空腹血糖、体质量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中，糖尿病组和辛伐他汀组大鼠空腹血糖高于对照组，体质量低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01，见表1）。对照组大鼠的精神状态较好，呼吸节律平稳，毛色发亮，反应灵敏，动作灵活，摄食摄水正常；糖尿病组大鼠精神萎靡，行动迟缓、嗜睡，皮毛枯黄无光泽，少数被毛脱落，饮水量增加，偶有大便干结；辛伐他汀组大鼠较糖尿病组，精神良好，体能恢复，皮毛少有枯黄，饮水量减少。

2.2 Morris水迷宫实验结果 对照组不同时间的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（F=2 487.91，P＜0.01），其中，对照组第1天的逃避潜伏期长于第2、3、4、5天，第2天的逃避潜伏期长于第3、4、5天，第3天的逃避潜伏期长于第4、5天，第4天的逃避潜伏期长于第5天，差异均有统计学意义（P＜0.05）。处理方法与时间对逃避潜伏期存在交互作用（P＜0.01）；干预方法、时间对逃避潜伏期的影响，主效果均显著（P＜0.01）。其中，糖尿病组和辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期长于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；辛伐他汀组第2、3、4、5天的逃避潜伏期短于糖尿病组，差异均有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.3 海马组织病理观察结果 显微镜观察显示，对照组海马神经元细胞结构完整，形态正常，无明显病理学改变，细胞膜结构完整、胞核完整、胞质丰富；糖尿病组海马神经元细胞形态不规则，排列紊乱、数量显著减少，细胞膜失去原有完整结构，核固缩，核仁部分消失；辛伐他汀组海马神经元细胞结构大致正常，数量略减少，少数细胞膜失去完整结构，胞核完整（见图1）。

2.4 mTOR/p70S6K信号通路蛋白表达水平 3组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中，糖尿病组和辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；辛伐他汀组的p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-tau/t-tau低于糖尿病组，差异均有统计学意义（P＜0.01，见表3、图2）。

2.5 氧化应激相关蛋白表达水平 3组的MDA/β-actin、GSH/β-actin比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中，糖尿病组和辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；辛伐他汀组的MDA/β-actin、GSH/β-actin低于糖尿病组，差异均有统计学意义（P＜0.01，见表4、图3）。

3 讨论

糖尿病是世界上最常见的代谢性疾病之一，由于其患病率日益增加，已经成为全球严重的公共卫生问题［8］。据估计，截至2035年，全球219个国家的糖尿病患者将达到381.8万人［9］。越来越多的证据表明T2DM与认知功能障碍和痴呆相关［10-11］。许多流行病学研究已经证明，T2DM患者发展为AD的风险明显增高［12-13］。T2DM与AD的发生密切相关，胰岛素信号传导障碍、糖基化终末产物（AGEs）的增加以及氧化应激水平的增强与AD的发生发展相关［14］。另外，以MDA和GSH为代表的氧化应激相关蛋白，也与糖尿病所致认知功能障碍有关［15］。高血糖能够通过多条途径影响认知功能，如mTOR/p70S6K信号通路、Akt/GSK3β信号通路和胰岛素降解途径，从而影响研究对象认知功能［16-17］。目前临床上还没有针对T2DM认知功能障碍的药物。他汀类药物作为经典的降低胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂蛋白的药物，已被证实具有中枢神经系统保护作用［18］。其中辛伐他汀更是具有抗炎、免疫调节和改善认知功能等多重获益［19］，不仅能够通过激活相关通路，抑制海马细胞凋亡［20］，而且能够改善细胞氧化应激水平［21］，增强空间定位和学习记忆能力。这种神经保护作用已经在多种动物模型中得到证实［22-23］，而辛伐他汀在T2DM认知功能障碍中的作用及潜在机制尚未被深入研究。

表1 3组大鼠空腹血糖和体质量比较（±s）Table 1 Comparison of fasting blood glucose and body mass among the three groups of rats

表1 3组大鼠空腹血糖和体质量比较（±s）Table 1 Comparison of fasting blood glucose and body mass among the three groups of rats

注：与对照组比较，aP＜0.01

组别 只数 空腹血糖（mmol/L） 体质量（g）对照组 40 6.0±0.6 521±15糖尿病组 38 17.3±2.3a 438±13a辛伐他汀组 37 17.2±2.3a 441±17a F值 460.905 381.845 P 值 ＜0.01 ＜0.01

表2 3组大鼠逃避潜伏期比较（±s，s）Table 2 Comparison of the escape latency among the three groups of rats

注：与对照组相比，aP＜0.01；与糖尿病组相比，bP＜0.01

组别 只数 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天对照组 40 97.3±1.8 80.5±3.2 74.3±1.8 67.7±0.9 53.3±1.9糖尿病组 38 97.2±1.8 92.5±3.0a 84.4±3.2a 78.6±4.2a 69.6±1.0a辛伐他汀组 37 97.3±0.9 85.4±4.1ab 77.3±1.9ab 74.4±3.2ab 60.2±2.2ab F 值 F交互=148.62，F组间=196.38，F时间=10 359.79 P 值 P交互＜0.01，P组间＜0.01，P时间＜0.01

表3 3组大鼠mTOR/p70S6K信号通路蛋白表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of mTOR/p70S6K pathway protein expression levels among the three groups of rats

表3 3组大鼠mTOR/p70S6K信号通路蛋白表达水平比较（±s）Table 3 Comparison of mTOR/p70S6K pathway protein expression levels among the three groups of rats

注：mTOR=雷帕霉素靶蛋白，p70S6K=p70核糖体蛋白S6激酶；与对照组比较，aP＜0.01；与糖尿病组比较，bP＜0.01

组别 只数 p-mTOR/mTOR p-p70S6K/p70S6K p-tau/t-tau对照组 40 0.51±0.10 0.48±0.10 0.55±0.02糖尿病组 38 0.81±0.06a 0.81±0.08a 0.79±0.08a辛伐他汀组 37 0.69±0.07ab 0.68±0.08ab 0.78±0.09ab F值 336.789 262.511 248.456 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图1 3组大鼠海马组织超微病理检测结果（HE染色，×400）Figure 1 Ultrastructural pathological test results of the hippocampus among the three groups of rats

图2 3组大鼠mTOR/p70S6K信号通路蛋白的表达Figure 2 Expression of protein in the mTOR/p70S6K pathway among the three groups of rats

表4 3组大鼠氧化应激相关蛋白表达水平比较（±s）Table 4 Comparison of oxidative stress-related protein expression levels among the three groups of rats

表4 3组大鼠氧化应激相关蛋白表达水平比较（±s）Table 4 Comparison of oxidative stress-related protein expression levels among the three groups of rats

注：MDA=丙二醛，GSH=谷胱甘肽；与对照组比较，aP＜0.01；与糖尿病组比较，bP＜0.01

组别 只数 MDA/β-actin GSH/β-actin对照组 40 0.45±0.04 0.49±0.12糖尿病组 38 0.80±0.05a 0.82±0.08a辛伐他汀组 37 0.65±0.06ab 0.68±0.07ab F值 458.872 285.590 P值 ＜0.01 ＜0.01

图3 3组大鼠氧化应激相关蛋白表达Figure 3 Expression of oxidative stress-related protein among the three groups of rats

本研究Morris水迷宫实验结果显示，随训练日数增加，糖尿病组大鼠逃避潜伏期显著长于对照组，表明糖尿病大鼠存在空间学习能力的缺陷。显微镜观察显示，糖尿病组大鼠海马组织神经元丢失和结构损害；辛伐他汀干预后显著缩短大鼠逃避潜伏期，海马神经元结构和完整性也有所改善。与对照组相比，糖尿病组大鼠海马组织mTOR、p70S6K和tau磷酸化水平明显增加，说明高糖刺激mTOR/p70S6K信号通路激活后，tau磷酸化水平增加。氧化应激产物MDA和GSH的表达水平随之升高。辛伐他汀干预后mTOR、p70S6K和tau磷酸化水平得到抑制，MDA和GSH的表达水平也随之降低。表明辛伐他汀能够抑制mTOR/p70S6K信号通路，同时发挥抗氧化作用。

mTOR/p70S6K信号通路是近年来分子生物学和细胞生物学的研究热点之一，p70S6K是mTOR下游的主要靶点之一，其磷酸化水平是评估mTOR活性的重要指标［24］。mTOR/p70S6K信号通路参与葡萄糖代谢和记忆形成，过度激活的mTOR / p70S6K信号通路被认为与认知功能障碍有关［25-26］。关于人体SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞、小鼠神经母细胞瘤细胞和原代皮质神经元等的多项研究中均发现，mTOR/p70S6K信号通路在tau过度磷酸化中有重要作用，mTOR和p70S6K的异常上调与AD脑组织中过度磷酸化tau的积累有关［27-28］。抑制mTOR与p70S6K表达能够改善学习和记忆，并减少转基因AD小鼠模型的tau磷酸化［29］。GAO等［30］研究证实辛伐他汀具有激活mTOR/p70S6K信号通路改善认知功能的作用。与此同时，研究显示Akt/mTOR/S6K信号通路的激活能够提高GSH表达水平［31］。本研究证明辛伐他汀抑制氧化应激产物的表达，发挥抗氧化作用，但具体是否通过激活mTOR/p70S6K信号通路发挥作用，有待进一步研究。

综上所述，T2MD认知功能障碍大鼠中，存在mTOR/p70S6K信号通路的激活和tau过度磷酸化和氧化应激水平的改变，辛伐他汀能够抑制mTOR/p70S6K信号通路的激活和tau的磷酸化程度，具有抗氧化作用，改善T2DM大鼠认知功能。今后的研究可以进一步在基因和细胞水平研究辛伐他汀通过mTOR/p70S6K信号通路在糖尿病脑病中的作用机制，为寻找治疗靶点提供理论依据。

作者贡献：张禾伟、房辉进行文章的构思与设计，撰写与修订论文，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责，监督管理；孙雪玲进行研究的实施与可行性分析；张禾伟、张雅中进行数据收集；孙雪玲、田金莉进行数据整理；张禾伟、田金莉进行统计学处理，结果的分析与解释。

本文无利益冲突。