响应面优化制备马面鱼皮胶原蛋白的预处理工艺研究

公维洁，卓先勤，杭瑜瑜，王卉，黄宝芬

（海南热带海洋学院，海南三亚572022）

我国鱼类资源十分丰富，种类繁多，但是快速发展的鱼类加工业给我们带来了大量的废弃物（鱼鳞、鱼皮、鱼骨、鱼内脏、鱼头等）。目前，我国水产加工和综合利用与发达国家相比存在较大差距，其水产品加工率为30%，低于发达国家的80%[1]。加工过程中的废弃物，大部分用于生产饲料鱼粉，有价值的成分利用率较低。研究发现，这些废弃物中含有丰富的胶原蛋白，尤其是鱼皮含量显著，可高达80%[2]。因此，鱼皮胶原蛋白的研究受到广大科学工作者的关注[3-7]。

鱼皮中除了含有丰富的胶原蛋白，还含有脂肪（约1.5%）、杂蛋白（约2%）及色素等杂质。这些杂质不仅会影响鱼皮中胶原蛋白的提取率，还会影响产品的感官品质和纯度，因此在提取之前需要对原材料进行脱脂除杂蛋白的预处理，预处理的效果会成为胶原蛋白提取的关键[8]。传统的脱脂方法有：蒸煮法[9]、碱法、有机溶剂萃取法[8]、酶法[10]、乳化法[11]；除杂蛋白的方法有：盐溶液浸泡法、碱法[12]。

马面鱼（Navodon septentrionalis）是我国排名第二位的海洋经济鱼类。在马面鱼加工过程中，鱼皮会整张丢弃，造成巨大的资源浪费。本研究以马面鱼皮为原料，探索如何去除马面鱼皮中的脂肪和杂蛋白，同时减少胶原蛋白的损失，以期得到高品质的马面鱼皮胶原蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马面鱼：市售。

L-羟脯氨酸、牛血清蛋白（生化试剂标准品）、氢氧化钠、氯化钠、碳酸氢钠、碳酸钠、酒石酸钾钠、无水硫酸铜、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、硫酸锂、液溴（分析纯）：山东西亚股份有限公司；正丁醇、异丙醇、无水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯（分析纯）：西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

721G-可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SE602F-电子天平：奥豪斯仪器（上海）有限股份公司；HH-数显恒温水浴锅：金坛市盛蓝仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 马面鱼皮预处理

将新鲜的马面鱼皮洗净，冻干，剪切成1 cm2碎片，于-20℃保存备用，使用时于4℃条件下解冻。

1.3.2 脱脂工艺优化

1.3.2.1 脱脂剂筛选

准确称取3 g的干燥马面鱼皮6份，分别加入正丁醇、异丙醇、无水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯150 mL进行脱脂处理，于4℃浸泡20 h，分离并挥干鱼皮中的溶剂，测定其脂肪含量，比较脱脂率，筛选出最佳脱脂剂。

1.3.2.2 脱脂单因素试验

1）脱脂剂浓度

在固定料液比为1∶50（g/mL），脱脂温度为4℃、脱脂时间20 h的条件下，用异丙醇溶液进行鱼皮脱脂，分别调节异丙醇浓度为5%、10%、15%、20%、25%浸泡鱼皮。测定其脂肪含量，并计算脱脂率。

2）脱脂时间

在固定料液比为1∶50（g/mL）、脱脂温度为4℃、异丙醇浓度为10%的条件下，进行鱼皮脱脂，分别浸泡鱼皮 6、12、18、24、30 h，进行脱脂处理。测定其脂肪含量，并计算脱脂率。

3）脱脂温度

在料液比为 1 ∶50（g/mL）、脱脂时间 20 h、试剂浓度为10%的条件下，进行鱼皮脱脂，分别调节脱脂温度为 20、25、30、35、40、45 ℃。测定其脂肪含量，并计算脱脂率。

4）料液比

在脱脂时间为20 h、脱脂温度为4℃、试剂浓度为10%的条件下，进行鱼皮脱脂，分别调节料液比为1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）。测定其脂肪含量，并计算脱脂率。

1.3.2.3 脱脂响应面优化设计

经过单因素试验的综合分析后，根据Box-Behnken的试验设计原则，以异丙醇浓度、脱脂时间、料液比为考察因素，马面鱼皮脱脂率为响应值，优化试验。试验因素与水平表见表1。

表1 脱脂响应面因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface on degreasing

1.3.2.4 脱脂率的计算

样品中脂肪含量采用索氏抽提法测定。

脱脂率/%=（1-脱脂后鱼皮中脂肪含量/鱼皮原料中脂肪含量）×100

1.3.3 除杂蛋白工艺优化

1.3.3.1 除杂蛋白试剂筛选

采用福林酚法[13]测马面鱼皮中杂蛋白的溶出量，根据Gabor Huszar的羟脯氨酸法[14]得到胶原蛋白的流失率。准确称取7份1 g的干燥马面鱼皮，分别用0.5mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl与 NaOH联用，NaCl与NaHCO3联用，NaCl与Na2CO3联用进行除杂蛋白处理，料液比为1∶50（g/mL），于4℃浸泡20 h。测定杂蛋白的除杂率和胶原蛋白的流失率。

1.3.3.2 除杂蛋白的单因素试验

1）试剂浓度对马面鱼皮除杂蛋白效果的影响

在固定料液比为1∶50（g/mL）、浸泡温度为4℃、时间20 h的条件下，分别配制均为0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L和0.5 mol/L的NaCl与NaOH联用溶液进行除杂蛋白处理，吸取除杂上清液，测定其杂蛋白的除杂率和胶原蛋白的流失率。

2）浸泡时间对马面鱼皮除杂蛋白效果的影响

在固定料液比为1∶50（g/mL）浸泡温度为4℃的条件下，用NaCl与NaOH联用进行马面鱼皮除杂蛋白处理，分别浸泡鱼皮 5、10、15 、20、25 h 和 30 h 后，吸取除杂上清液，测定其杂蛋白的除杂率和胶原蛋白的流失率。

3）料液比对马面鱼皮除杂蛋白的效果的影响

在固定浸泡温度为4℃、时间20 h的条件下，用NaCl与NaOH联用溶液进行马面鱼皮除杂蛋白处理，分别调节料液比为 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20（g/mL）和1∶25（g/mL），吸取除杂上清液，测定其杂蛋白的除杂率和胶原蛋白的流失率。

1.3.3.3 除杂蛋白响应面优化设计

经过单因素试验的综合分析后，根据Box-Behnken的试验设计原则，以NaCl与NaOH联用浓度、浸泡时间、料液比为考察因素，马面鱼皮杂蛋白的除杂率为响应值，优化试验。试验因素与水平表见表2。

表2 除杂蛋白响应面因素与水平表Table 2 Factors and levels of response surface on removing impurity proteins

1.3.3.4 计算公式

鱼皮中杂蛋白的溶出率，按照该公式进行计算：

式中：Y表示鱼皮杂蛋白的溶出率，%；c表示上清液蛋白质的浓度，μg/mL；V表示上清液蛋白质的体积，mL；W表示湿鱼皮的质量，g。

1.4 数据处理方法

试验数据采用excel和origin9.1软件分析绘图，采用统计分析软件DesignExpert8.0.6.1进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 脱脂工艺优化

2.1.1 脱脂剂筛选

分别采用异丙醇、正己烷、乙醚、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯进行脱脂处理，比较不同试剂的脱脂效果见图1。

图1 不同试剂的脱脂效果Fig.1 Effect of degreasing agent type on degreasing efficiency

由图1所示，在同等条件下，异丙醇的脱脂率最高，为53.04%；其他依次是乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、正己烷、石油醚，脂肪脱脂率分别为47.16%、43.80%、41.20%、37.58%、28.32%。此外，异丙醇较其它试剂更具安全性，故本试验选用异丙醇为最优脱脂剂。

2.1.2 脱脂单因素试验

2.1.2.1 脱脂剂浓度的影响

保持其他条件不变，分别用5%、10%、15%、20%、25%的异丙醇溶液进行脱脂处理，脱脂结果见图2。

图2 脱脂剂浓度对脱脂率的影响Fig.2 Effect of reagent concentration on degreasing efficiency

如图2所示，脱脂剂浓度对脱脂率的影响较大，随着浓度的提高，脱脂率先升高后降低。异丙醇浓度为15%时，脱脂率达到最高。故选择异丙醇浓度5%～15%作为适宜的脱脂浓度范围。

2.1.2.2 脱脂时间的影响

保持其他条件不变，用10%的异丙醇分别脱脂6、12、18、24、30 h，脱脂结果见图 3。

图3 脱脂时间对脱脂率的影响Fig.3 Effect of treatment time on degreasing efficiency

如图3所示，随着脱脂时间的延长，马面鱼皮的脱脂率不断提高，当脱脂时间达到24 h后，脱脂率变化缓慢，可能是因为随着脂肪不断溶出，溶剂达到饱和，导致脂肪不再溶出。故选择18 h～30 h作为最佳的范围脱脂时间。

2.1.2.3 脱脂温度的影响

保持其他条件不变，用10%的异丙醇分别在20、25、30、35、40、45 ℃进行脱脂处理，脱脂结果见图 4。

图4 不同脱脂温度的脱脂效果Fig.4 Effect of temperature on degreasing efficiency

如图4所示，随着温度的升高，马面鱼皮脱脂率逐渐升高，40℃后脱脂率略有降低，考虑到高温易使胶原蛋白变性，并提高生产成本，故选择40℃作为最佳的脱脂温度。

2.1.2.4 料液比的影响

保持其他条件不变，用10%的异丙醇分别在料液比为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30 （g/mL） 进行脱脂，脱脂结果见图5。

图5 不同料液比的脱脂效果Fig.5 Effect of solid-to-liquid ratio on degreasing efficiency

如图5所示，当料液比为1∶15（g/mL）时，脂肪脱脂率最高，达到78.66%，当料液比超过1∶15（g/mL）时，脱脂率显著下降。由此可见，适当的料液比可以促进脂肪溶出，过高的料液比反而导致脱脂效果下降，故选择料液比 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）作为最佳的范围。

2.1.3 脱脂的响应面结果与分析

2.1.3.1 脱脂的响应面试验设计及数值分析

对马面鱼皮脱脂工艺进行响应面优化，结果见表3。利用Desigin-Expert.V8.0.6.1软件对表3进行了拟合分析，得到了回归方程方差分析表4，并得到了脱脂响应面回归模型方程为：脱脂率（Y）=+93.91+1.51A+2.71B2.94C-1.89AB-0.23AC+2.83BC-2.91A2-5.16B2-5.42C2。由表4可知，该模型的P＜0.000 1，表明响应面回归模型达到极显著水平，且相关系数：R2=0.977 5，表明试验误差较小，各因素之间线性关系显著，可以用于马面鱼皮的脱脂工艺试验的预测。

表3 脱脂的响应面设计及结果Table 3 The design and results of box-behnken on degreasing

表4 脱脂的回归方程各项方差分析Table 4 Analysis of variance for regression coefficient on degreasing

方程中一次项B、C对脱脂率的影响极显著，A对其影响显著。交互项BC对脱脂率的影响极显著，AB对其影响显著，AC对其影响不显著。二次项A2、B2、C2对脱脂率的影响均为极显著。故各单因素对马面鱼皮的脱脂影响不是简单的线性关系。由表中F值可知，影响脱脂率的因素的主次顺序为：料液比>脱脂时间>异丙醇浓度。

2.1.3.2 脱脂响应面图分析

响应面图形能较直观地反映出各因素对响应值的影响，响应面坡度越陡，表明该因素对响应值影响越显著，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱。各因素间相互作用对脱脂鱼皮脱脂率的影响见图6。

图6 各因素相互作用对马面鱼皮脱脂率的影响Fig.6 Interaction effect on degreasing efficiency

由图6可以看出，马面鱼皮的脱脂条件中，料液比对脱脂效果的影响最为显著，表现的曲面相对其他的要陡，脱脂时间次之，且料液比与脱脂时间的交互作用最为显著，表现的等高线图最为椭圆形，而脱脂时间与异丙醇浓度的作用效果最小，等高线图为圆形，这与模型方差的分析结果相一致。

2.1.3.3 脱脂工艺优化后参数验证

优化分析，得到脱脂最优工艺为：异丙醇浓度为15%，时间为 24.96 h，料液比为 1 ∶16.46（g/mL），理论值为92.9%。考虑到试验操作可行性，将最佳脱脂条件改为：异丙醇浓度15%、脱脂时间25 h、料液比为1∶15（g/mL），在此条件下进行3次重复试验，实际测得的脱脂率分别为：93.14%、92.78%和93.37%，平均脱脂率值为93.10%，与理论值的相对误差为0.2%。说明采用响应面法优化马面鱼皮的脱脂工艺准确可靠，具有实际可操作性。

2.2 除杂蛋白工艺优化

2.2.1 除杂蛋白试剂筛选

分别用 0.5 mol/L 的 NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、NaCl与 NaOH 联用，NaCl与 NaHCO3联用，NaCl与Na2CO3联用进行除杂蛋白处理，比较不同试剂的除杂效果见图7。

如图7所示，在同等条件下，0.5 mol/L的NaCl与NaOH联用除杂蛋白的效果最佳，除杂率达到41.54%，同时胶原蛋白的流失率最低，为0.3%，故选择NaCl与NaOH联用为最佳的除杂蛋白试剂。

图7 不同试剂的除杂蛋白效果Fig.7 Effect of degreasing agent type on impurity proteins removal rate

2.2.2 除杂蛋白单因素分析

2.2.2.1 试剂浓度的影响

保持其他条件不变，分别配制均为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl与NaOH联用溶液进行除杂蛋白处理，除杂及胶原蛋白流失结果见图8。

图8 不同试剂浓度的除杂蛋白效果Fig.8 Effect of reagent concentration on impurity proteins removal rate

由图8可知，当NaCl与NaOH联用溶液的浓度均为0.3 mol/L时杂蛋白除杂效果最好，为25.13%，胶原蛋白流失效果相对较低，故选NaCl与NaOH联用溶液浓度均为0.2 mol/L～0.4 mol/L作为最佳的范围浓度。

2.2.2.2 浸泡时间

保持其他条件不变，用NaCl与NaOH联用进行马面鱼皮除杂蛋白处理，分别浸泡鱼皮 5、10、15 、20、25、30 h后，除杂及胶原蛋白流失结果见图9。

图9 不同浸泡时间的除杂蛋白效果Fig.9 Effect of treatment time on impurity proteins removal rate

由图9可知，浸泡时间对胶原蛋白的流失影响较小，当NaCl与NaOH联用浸泡时间为25 h时除杂蛋白效果最好，故选择的最佳的范围除杂时间为20 h～30 h。

2.2.2.3 料液比

保持其他条件不变，用NaCl与NaOH联用进行马面鱼皮除杂蛋白处理，分别调节料液比为1∶5、1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL），除杂及胶原蛋白流失结果见图10。

图10 不同液料比的除杂蛋白效果Fig.10 Effect of solid-to-liquid ratio on impurity proteins removal rate

由图10可知，随着液料比的增加，杂蛋白除杂率逐渐增加，胶原蛋白流失率逐渐递减，当液料比增加到20（g/mL）之后，杂蛋白除杂率增加趋势缓慢，胶原蛋白流失率递减的趋势也趋于平缓，故选择液料比15（mL/g）～ 25（mL/g）作为最佳范围。

2.2.3 除杂蛋白的响应面分析

2.2.3.1 除杂蛋白响应面试验设计及数值分析

对马面鱼皮除杂蛋白工艺进行响应面优化，结果见表5。

表5 除杂蛋白响应面结果Table 5 The design and results of Box-Behnken on removing impurity proteins

根据表5数据进行了拟合分析，得到了回归方程：杂蛋白除杂率（Y）=30.59+2.36A-0.69B+3.01C-1.36AB-1.30AC+1.50BC-7.80A2-2.24B2-4.40C2。

对回归模型的显著性分析见表6，该模型的P＜0.000 1，表明响应面回归模型达到极显著水平，且相关系数：R2=0.992 0，表明试验误差较小，各因素之间线性关系显著，可以用于马面鱼皮的除杂蛋白工艺试验的预测。

表6 除杂蛋白的回归方程各项方差分析Table 6 Analysis of variance for regression coefficient on removing impurity proteins

方程中一次项A、C对除杂率的影响均极显著，B对除杂率的影响显著。交互项BC对除杂率的影响极显著，AB、AC 对其影响显著。二次项 A2、B2、C2对除杂率的影响均极显著。故各单因素对马面鱼皮的除杂蛋白影响不是简单的线性关系。由表中F值可知，影响除杂率的因素的主次顺序为：料液比>NaCl与NaOH联用浓度>浸泡时间。

2.2.3.2 除杂蛋白响应面图分析

根据回归方程，得到各因素间交互作用对杂蛋白提取率的影响，见图11。

如图11所示，马面鱼皮除杂蛋白的条件中，液料比对除杂蛋白的效果的影响最为显著，表现的曲面相对其他的要陡，NaCl与NaOH联用浓度次之，浸泡时间影响最小。由等高线图c可以看出，浸泡时间与液料比的交互作用对脱脂率的影响最为显著。

2.2.3.3 除杂蛋白工艺优化后参数验证

根据软件分析，得到除杂蛋白最优工艺为：NaCl与NaOH联用浓度为0.31 mol/L，时间为24.55 h，料液比为1∶22（g/mL），理论值为31.24%。根据实际情况，调整为NaCl与NaOH联用浓度为0.3 mol/L，时间为25 h，料液比为 1 ∶20（g/mL），在此条件下进行 3 次重复试验，实际测得的除杂率为31.09%，与理论值基本吻合。说明采用响应面法优化马面鱼皮的除杂蛋白工艺准确可靠，具有实际可操作性。

图11 各因素相互作用对马面鱼皮脱脂率的影响Fig.11 Interaction effect on impurity proteins removal rate

3 结论

以马面鱼皮为原料，分别对鱼皮中的脂肪和杂蛋白的脱除工艺进行了研究。利用溶剂萃取法脱脂，且采用索氏抽提法测定马面鱼皮中的脂肪含量；利用福林酚法测定马面鱼皮中的杂蛋白含量。通过单因素试验和响应面优化得到马面鱼皮脱脂最佳条件为：采用异丙醇溶液为脱脂试剂，浓度15%，料液比为1∶15（g/mL），在 40℃时处理 25 h，脂率值达到93.10%；除杂蛋白最佳条件为：采用NaCl与NaOH联用溶液进行鱼皮除杂蛋白处理，浓度均为0.3 mol/L，料液比1∶20（g/mL），处理25 h，不仅能大大的除去杂蛋白，还能降低胶原蛋白的流失率，平均除杂率为31.09%。本试验对脱脂条件优化后，脱脂率较夏姗姗等[15]试验的脱脂率有所提高，为马面鱼皮的深加工提供理论依据。

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