外泌体在脑卒中发病机制及治疗中的作用

张辉 王运良

1 脑卒中的病理生理

缺血性脑卒中主要由大脑动脉血栓栓塞引起，当栓子或血栓原位阻塞脑动脉时，循环的血小板迅速聚集到阻塞的血管部位，与组织因子激活凝血过程产生凝血酶和纤维蛋白，是形成动脉血栓的主要原因[1]。同时，脑动脉闭塞引发下游微血管继发性血栓形成，导致脑内皮细胞、外周细胞和星形细胞功能障碍并导致血脑屏障（BBB）破坏和细胞缺血性损伤[2]。因此，缺血性脑卒中的首要目标是闭塞血管的迅速再通，在缺血性脑微血管床重建CBF，保持血管完整性，减少神经元死亡。脑卒中恢复过程中，缺血脑组织经历一系列重塑事件，激活血管相对静止的内皮细胞，引起脑血管生成。除内皮细胞外，循环内皮祖细胞也参与新血管生成。血管生成不仅发生在梗死周围，也发生在侧脑室/脑室下区（V/SVZ）。在恢复早期，生成的血管具有渗透性，当新血管成熟时，渗透功能下降，因此，血管生成与改善神经系统预后密切相关[3]。

神经干细胞存在于成年啮齿类脑V/SVZ和齿状回亚颗粒区，在整个生命周期产生新的神经元。动物实验发现，脑卒中增加神经发生，在缺血脑组织也观察到神经祖细胞和神经母细胞增加。脑卒中引起的神经发生与血管生成相结合，诱导神经干细胞增殖与脑内皮细胞活化有关[4]。V/SVZ新生成的神经母细胞沿脑血管迁移至梗死周围区域，在脑修复过程中起功能性作用，除祖细胞外，神经干细胞还产生少突胶质祖细胞（OPCs），并分化成髓鞘化的少突胶质细胞。在脑修复过程中，OPCs产生的少突胶质细胞在梗死周围灰质和白质再生轴突形成髓鞘[5]。

2 外泌体功能

2.1 外泌体与miRNAs

实验研究提示细胞内和细胞间分子通过自分泌和旁分泌作用介导脑重塑过程，在小鼠局灶性缺血模型，血管miRNA-15a（miR-15a）下调通过增加成纤维细胞生长因子2（FGF2）和血管内皮生长因子（VEGF）水平，促进梗死周围区诱导的血管生成，血管生成内皮细胞释放VEGF也与神经祖细胞受体VEGFR2相互作用，促进其增殖和神经元分化。而且，脑白质内皮细胞通过脑源性神经营养因子（BDNF）和FGF2参与损伤后脑内髓鞘化少突胶质细胞的再生[6]。体外研究发现，脑脑卒中诱导miR-9和miR-200b表达下调介导白质髓鞘再形成，而反应性星形胶质细胞产生的硫酸软骨素蛋白聚糖（CSPGs）抑制轴突再生。miR-17-92簇或miR-27a在皮层神经元过表达，通过抑制磷酸酶、磷酸酯酶、张力蛋白同源物（PTEN）和Ras同源物家族成员A（RhoA）信号，激活神经元内生长信号，从而克服CSPG的抑制作用。成年脊髓损伤动物研究表明抑制神经元PTEN信号也能促进轴突芽生[7]。

外泌体介导的细胞间联系将物质从源细胞转移到目标细胞，有助于大脑重塑。从CSF分离的外泌体富含四肽蛋白（CD63，CD81），转运体内Alix调控因子和伴侣蛋白HSP70。四跨膜蛋白、Alix和HSP70已作为外泌体的标记物，蛋白组学和RNA分析表明外泌体携带脂质、蛋白质和RNA，包括mRNA和miRNA，但不清楚这些物质是如何装入单个外泌体的[8-9]。体内研究表明，转基因小鼠外泌体过表达人类β-淀粉样蛋白（Aβ）前体蛋白（APP），含有高水平的完整APP和APP的C末端片段。与阿尔茨海默病（AD）患者脑组织外泌体内检测到的APP和C末端片段一致，认为Aβ肽的释放与外泌体有关，富含神经毒素APP的C末端片段可能导致Aβ肽向大脑播散[10]。

2.2 外泌体与脑血管生成

循环内皮祖细胞外泌体转运mRNAs和PI3K/Akt信号以及miRNAs，进入受体内皮细胞导致血管生成。培养的胶质瘤细胞的外泌体通过释放促血管生成蛋白、mRNAs和miRNAs进入脑内皮细胞来诱导血管生成。在LPS和细胞因子的刺激下，小鼠脑内皮细胞分泌外泌体转运miRNAs，增加受体血管外周细胞VEGF-B mRNA和蛋白水平，VEGF-B及其受体VEGFR-1介导血管生成。此外，脑内皮细胞和外周细胞之间Notch信号通路激活是脑血管生成和血脑屏障完整性的必要条件，Notch信号通路与VEGF相互作用介导血管生成，维持血脑屏障的完整性[11]。蛋白组学和miRNA阵列分析显示，脑卒中可改变外泌体载脂蛋白和miRNA，提示脑脑卒中可改变脑内皮细胞和神经祖细胞外泌体含量。缺血性神经祖细胞来源的外泌体促进原发性内皮细胞迁移和毛细管形成，而脑内皮细胞来源的外泌体促进神经祖细胞增殖和神经元分化[12]。

2.3 外泌体与神经发生

成年啮齿动物脑V/SVZ区神经干细胞与邻近血管、细胞和脑脊液接触，不断交换分子信号。脑脊液外泌体和神经干细胞通过调节细胞间通路，分别介导神经干细胞和免疫功能。从胚胎脑脊液分离的外泌体含有IGF信号通路蛋白和miRNA成分，胚胎干细胞与CSF外泌体孵育激活神经干细胞的IGF/mTORC1通路，促进干细胞增殖[13]。成年小鼠V/SVZ神经干细胞的促炎因子导致mRNAs编码IFN-γ信号通路的外泌体释放，外泌体通过相关IFN-γ及其受体IFNGR1激活受体细胞STAT1信号。脑脑卒中可激活先天和适应性免疫应答，因此，神经干细胞释放的外泌体也在脑卒中与免疫系统发生联系[14]。

2.4 外泌体与神经可塑性

皮层神经元释放外泌体携带谷氨酸受体神经元特异性蛋白L1细胞粘附分子（L1CAM）和GluR2/3亚基，神经元胞质钙的增加和神经元去极化增加外泌体的分泌。神经元释放的外泌体含有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体，去极化神经元神经突分泌的外泌体富含微管相关蛋白1b（MAP1b）和靶向神经突可塑性相关基因miRNA，导致神经突生长增强[15]。RARβ受体激动剂灭活皮质神经元PTEN信号，增强星形胶质细胞的增殖。皮层神经元释放外泌体将miR-124转移至星形细胞，增加星形细胞兴奋性氨基酸转运体GLT-1表达。AMPA受体和MAP1b是突触和树突可塑性及轴突芽生的关键因子，AMPA受体激活有助于脑卒中后运动功能的恢复，抑制神经元PTEN信号和减少星形细胞瘢痕，促进脊髓损伤和脑卒中后CNS轴突芽生[16]。因此，神经元外泌体通过神经元之间的突触转运及与星形细胞的联系，介导突触和轴突的可塑性，参与缺血后轴突和突触重塑。

2.5 外泌体与认知缺失

脑卒中加速认知减退和AD发生，特点是脑内Aβ分泌到细胞外环境，产生和清除之间的不平衡导致Aβ积累。培养的神经母细胞瘤细胞分泌的外泌体含有Aβ，经小胶质细胞内化的神经元外泌体增强小胶质细胞接受和降解Aβ的能力[17]。此外，他汀类药物刺激小胶质细胞分泌富含胰岛素降解酶（IDE）的外泌体，促进细胞外Aβ肽的清除。辛伐他汀治疗脑脑卒中及创伤性脑损伤（TBI）增强脑缺血修复过程，包括轴突芽生，改善自身物体识别和时间顺序记忆[18]。但他汀类药物是否改变小胶质细胞外泌体降解Aβ的能力还有待证实。

3 骨髓间充质干细胞（MSC）源性外泌体

MSCs可改善脑卒中和脑外伤后的神经功能预后，研究表明MSCs促进脑损伤后血管生成、神经发生和白质重塑，通过分泌因子参与脑修复的信号通路。MSCs对脑实质细胞的旁分泌作用，而非细胞替代，是MSC治疗益处的基础。与其他细胞相比，MSCs分泌大量的外泌体，调节脑微环境，对脑卒中和脑外伤有治疗作用[19]。局灶性脑缺血大鼠静脉注射MSC来源的外泌体，通过促进脑卒中恢复过程的神经血管重构，改善神经功能。全身应用MSC减少运动协调功能缺失，增加血管生成和神经发生，而应用人MSC治疗TBI小鼠，在很大程度上保留空间学习能力。提示MSC来源的外泌体介导细胞-细胞间联系有助于MSC治疗的疗效。

外泌体将载体miRNA转移到受体细胞，miRNA与argonaute2（AGO2）结合，称为RNA诱导沉默复合物（RISC）。研究发现，携带miRNA的工程MSC外泌体使脑卒中诱导的脑缺血miR-133b下调。皮质神经元外泌体可下调RhoA并促进神经突生长，而应用miR-133b升高的外泌体处理星形胶质细胞则抑制CTGF。总之，MSC源性外泌体可调控受体神经元和星形胶质细胞基因的miRNA载体，脑卒中诱导外周血免疫抑制，加重脑卒中结果，给予MSC来源的外泌体可与外周血中的自然杀伤细胞和淋巴细胞发生联系，以减轻缺血后免疫抑制[20]。

4 造血干细胞（HSC）外泌体

心肌缺血研究表明，CD34+造血干细胞（HSCs）源性重组蛋白（Shh）外泌体能转移Shh功能和激活受体细胞Shh信号通路，增强梗死边缘血管生成和维持心脏功能。Shh对神经发生的调控发挥重要作用，可传递功能蛋白来调节受体细胞功能，促进脑卒中后的脑重构[21]。

外泌体能通过血脑屏障，经鼻给予标记的外泌体，荧光颗粒可分布整个大脑，以嗅球为著。小鼠海马注射含有外泌体的Cre-重组酶mRNA，激活海马神经元lacZ报告基因，表明外泌体Cre重组酶mRNA激活受体神经元的报告基因[22]。此外，静脉注射表达融合蛋白的外泌体，显示其靶向细胞为脑内神经元、小胶质和少突胶质细胞。说明外泌体不仅能穿过血脑屏障，而且能传递功能物质，在大脑特定受体细胞触发基因表达。

5 结论

外泌体在脑脑卒中和神经损伤后修复过程中发挥重要的细胞间作用，无论是自体产生还是从干细胞/祖细胞提取的工程外泌体，都具有治疗价值。但仍有许多问题需要阐明：一是如何识别缺血后脑实质和远端器官释放外泌体的含量和细胞信号；其次是外泌体如何影响脑受体细胞内源性基因和蛋白质表达；三是确定脑细胞源性外泌体的靶向细胞类型。总之，外泌体作为缺血性脑细胞间的一种联系，为脑卒中发病机制提供新的见解，有助于外泌体治疗的发展，促进脑卒中的康复。