铁皮石斛、流苏石斛及紫皮石斛中总多糖含量测定研究

陈丹 吴梅青 张广宁 李金科 李柯

【摘 要】 目的：建立鐵皮石斛、流苏石斛及紫皮石斛中总多糖的含量测定方法。方法：采用紫外分光光度法，以无水葡萄糖为对照品，在483nm波长处测定铁皮石斛、流苏石斛及紫皮石斛中总多糖的含量。结果：无水葡萄糖在1.742～12.191μg·mL-1质量浓度范围内具有良好的线性关系，r=0.999 3;平均回收率为99.8%，RSD为3.29%。铁皮石斛中总多糖含量在35.64～39.39g·100g-1之间，流苏石斛总多糖含量在9.25～12.82g·100g-1之间，紫皮石斛总多糖含量在32.57～37.27g·100g-1之间。结论：不同品种含量差异较大，采用紫外分光光度法测定石斛中总多糖含量的方法操作简便、快速，具有较好的专属性和准确性。

【关键词】 铁皮石斛;流苏石斛;紫皮石斛;无水葡萄糖;紫外分光光度法

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）22-0050-05

Content Determination of Total Polysaccharides in Dendrobium Officinale，

Dendrobium Fimbriatum and Dendrobium Devoninum

CHEN Dan1 WU Meiqing1 ZHANG Guangning1 LI Jinke1 LI Ke2*

1.Xiangtan Medicine Health Vocational College，  Xiangtan 411102，China;

2.Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine，  Changsha 410013，China

Abstract：Objective  To establish a method for content determination of total polysaccharides in Dendrobium officinale， Dendrobium fimbriatum and Dendrobium devoninum. Methods The content of total polysaccharides in Dendrobium officinale， Dendrobium fimbriatum and Dendrobium devoninum was determined by ultraviolet spectroscopy with anhydrous glucose as reference substance at 483nm wavelength. Results Anhydrous glucose showed good linearity in the range of 1.742～12.191 μg·mL-1（r=0.999 3）， and the average recovery rate（n=6）of the anhydrous glucose was 99.8%， and RSD was 3.29%. The content ranges of polysaccharides in Dendrobium officinale， Dendrobium fimbriatum and Dendrobium devoninum in different batches were 35.64～39.39 g·100g-1， 9.25-12.82 g·100g-1， 32.57-37.27 g·100g-1. Conclusion There was large difference in content of different varieties， the method of determining the total polysaccharide content in Dendrobium by ultraviolet spectrophotometry is simple and rapid， and has good specificity and accuracy.

Keywords：Dendrobium officinale; Dendrobium fimbriatum; Dendrobium devoninum; Anhydrous glucose; Ultraviolet Spectroscopy

中药石斛始载于《神农本草经》，被列为上品，具有益胃生津，滋阴清热等功效。2015版《中药药典》中规定石斛为兰科植物金钗石斛Dendrobium nobile Lindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxum Lindl.或流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎。另外，兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo由于使用广泛，且野生资源稀缺，人工栽培成本高，日渐成为了名贵的中药品种[1-2]。药材市场上多有不法商贩以同属其它植物进行冒充，如兰科植物紫皮石斛D. devouianum由于在外形上与铁皮石斛极为相似，但价格又远低于铁皮石斛，多被用于冒充铁皮石斛来销售和使用[3-4]。石斛在临床上常用于缓解人体疲劳、增强免疫力、改善胃肠道功能、治疗糖尿病与辅助抗肿瘤等[5-9]，现代研究表明，石斛的药理作用与其所含多糖有着密切关联。本研究以葡萄糖为对照品，采用紫外分光光度法对3个不同品种多批次的石斛中总多糖含量进行测定，进一步了解不同石斛中总多糖的差异。

1 仪器与材料

1.1 仪器 UV-2450型紫外分光光度计（日本，岛津）、METTLER AE240型分析天平（瑞士METTLER）、HX-06超声波清洗器（武汉市恒信世纪科技有限公司）、80-2離心沉淀器（上海手术器械厂）、DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 药材与试药 试药：无水葡萄糖对照品（批号110833-201205，含量为99.5%，供含量测定用）均购自中国食品药品检定研究院;所用试剂均为分析纯;纯净水：华润怡宝饮料（中国）有限公司提供。

药材：铁皮石斛药材经湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎;紫皮石斛药材经湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为兰科植物紫皮石斛Dendrobium devouianum的干燥茎;流苏石斛药材经湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为兰科植物流苏石斛Dendrobium fimbriatum Hook.的干燥茎。样品来源见表1。

2 总多糖含量测定[10-12]

2.1 对照品溶液的制备 精密称取无水葡萄糖对照品适量，加水制成每1mL含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

2.2 标准曲线的制备 精密量取无水葡萄糖对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.4mL，分别置10mL具塞试管中，各加水补至2.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀，精密加入硫酸10mL，摇匀，置沸水浴（98～100℃）中加热15min，取出，置冰浴中冷却5min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2015年版四部通则0401），在483nm的波长处测定吸光度，结果见表2。

以无水葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程为y=0.0457x+0.0536，r=0.999 3，结果表明无水葡萄糖在浓度1.742～12.191μg·mL-1范围内与吸光度值呈良好良性关系。

2.3 测定波长的选择 精密量取无水葡萄糖对照品溶液1mL，置10mL具塞比色管中，精密加入5%苯酚溶液1mL，摇匀;精密加入浓硫酸10mL，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出，立即置冰浴冷却，于400～700nm进行扫描，得最大吸收波长。结果无水葡萄糖标准溶液在483nm处有最大吸收，故选择483nm波长为测定波长。如图1所示。

2.4 供试品溶液的制备 取铁皮石斛粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，加水 200 mL，加热回流 2 h，放冷，转移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液 2 mL，置 15 mL离心管中，精密加入无水乙醇8mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心（4000转/min）10min，弃去上清液（必要时滤过），沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀以2 mol·L-1的硫酸5 mL溶解，转移至25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.5 测定 精密量取供试品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得。

2.6 精密度试验 精密量取无水葡萄糖对照品溶液1 mL，置10 mL具塞试管中，加水补至2.0 mL，照标准曲线制备项下的方法，自“精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，连续测定6次，记录吸光度值，计算吸光度值的RSD为0.86%。结果表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取铁皮石斛（批号：201603009）适量，按“2.4供试品溶液制备”项下的方法制备，并依“2.5测定”项下的方法分别于0、2、4、6、8、12 h测定吸光度值，计算吸光度值的RSD。结果表明，供试品溶液在 12 h内稳定性良好。见表3。

2.8 重复性试验 取铁皮石斛（批号201603009）适量，按“2.4供试品溶液制备”项下的方法制备6份溶液，并依“2.5测定”项下的方法测定吸光度值，计算总多糖含量，结果表明，方法重复性良好。见表4。

2.9 回收率试验 取铁皮石斛粉末（批号201603009），取约0.25g，精密称定，平行6份，加水200mL，加热回流2h，放冷，转移至250mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，分别置15mL离心管中，精密加入无水乙醇8mL，摇匀，冷藏1h，取出，离心（4000转/min）10min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8mL，离心，弃去上清液，向沉淀中加入无水葡萄糖对照品溶液（0.85mg/mL）1.0mL，再以2mol·L-1的硫酸5mL溶解，转移至25mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得供试品溶液。并依“2.5测定”项下的方法对样品进行测定，计算葡萄糖回收率。结果见表5。

2.10 样品含量测定 分别取铁皮石斛、紫皮石斛与流苏石斛适量，粉碎过三号筛，紫皮石斛取约0.5g、铁皮石斛取约0.5g、流苏石斛取约2g，精密称定，分别按“2.4供试品溶液制备”项下的方法制备，并依“2.5测定”方法对样品进行测定，计算总多糖含量。结果见表6。

3 讨论

本试验所测定的3种石斛中，紫皮石斛中总多糖含量与铁皮石斛差异较小，含量均超过药典中铁皮石斛中多糖的规定，而流苏石斛含量最低。试验结果说明铁皮碱石斛与紫皮石斛多糖含量相近，从多糖具有缓解人体疲劳、增强免疫力、改善胃肠道功能、治疗糖尿病与辅助抗肿瘤等作用考虑，紫皮石斛同样具有开发利用前景，但紫皮石斛是否可以替代铁皮石斛入药，然需要进一步进行药效与化学成分对比研究。本實验中3种石斛不同批次间多糖含量有差异，是因实验采集的样品来源于不同的产地、生态环境、生长年限均不同。

供试品溶液的制备过程中，比较了取样量（0.25 g、0.5 g、1 g、2 g、3 g），取样量为0.25 g时，吸收值小于0.3，取样量为0.5～3 g时，吸收值在0.3～0.7之间，但取样量为2 g和3 g时，多糖含量反而减少，分析原因可能是显色剂达到饱和，因此紫皮石斛与铁皮石斛取样量以0.5 g合适，但流苏石斛因多糖含量较低，为了确保吸收值在线性范围内，计算准确，因此取样量以 2 g 为宜。同时比较了回流时间（1 h、2 h、3 h、4 h），提取1 h多糖含量较低，3 h、4 h与2 h多糖含量无差别，但耗能多，因此选择回流2 h。

加样回收率试验中，铁皮石斛药材中加入一定量无水葡萄糖按供试品溶液制备、测定，结果无水葡萄糖的的回收率仅40%～50%，分析原因是制备过程中沉淀加80%乙醇洗涤2次，无水葡萄糖因溶于80%乙醇而损失，因此将无水葡萄糖直接加入到沉淀中定容后再进行回收率试验。

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（收稿日期：2019-09-12 编辑：刘 斌）