苗药铁筷子醇提物对心肌缺血性大鼠模型病理改变 血脂及TNF-α、IL-6和IL-18的影响

李雪斐 鲁尚德 陈铭 钱海兵

【摘 要】 目的：觀察铁筷子醇提物对心肌缺血影响，初步探索铁筷子醇提物对于心肌的保护作用。方法：以高脂饲料+维生素 D2+盐酸异丙肾上腺素造模，雄性SD大鼠36只随机分成空白组、模型组、阳性组、铁筷子醇提物高、中、低剂量组，HE染色法检测心肌组织的病理变化情况，血清血脂四项检测，Elisa试剂盒检测大鼠CK-MM、CK-MB、TNF-α、IL-6、IL-18。结果：心肌组织HE染色提示：与正常组相比，模型组与给药组心肌细胞都出现了不同程度的血管充血、出血、间质水肿、炎症细胞浸润，其中高剂量组心肌损伤最轻。结果显示：与模型组比，给药组和阳性组TC、TG、HDL-C、LDL-C表达降低（P<0.05）有统计学意义。血清心肌酶结果显示，与模型组比，正常组及给药组CK-MM，CK-MB、TNF-α、IL-6、IL-18表达显著降低（P<0.05）。结论：铁筷子醇提物对大鼠心肌缺血所造成的心肌损伤具有保护作用，并且能改善心肌供血，降低血清中血脂、炎症因子、血清酶的表达其机制可能与减低血脂有关。

【关键词】 铁筷子醇提物;心肌缺血;血脂四项;TNF-α;IL-6;IL-18

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）22-0022-06

Effects of Ethanol Extracts of Miao Medicine Iron Chopsticks on Pathological Changes，

Blood Lipids， Tnf-alpha， Il-6 and Il-18 In Myocardial Ischemic Rats

LI Xuefei LU Shangde CHENG Ming QIAN Haibing*

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China

Abstract：Objective To observe the effect of iron chopstick alcohol extract on myocardial ischemia and the protective effect of iron chopstick alcohol extract on myocardium. Methods High fat forage + vitamin D2 + isopropyl adrenaline hydrochloride building， 36 male SD rats randomly divided into blank group， model group， positive， iron chopsticks alcohol extraction of high， medium and low dose group， HE staining method to detect the pathological changes of the myocardial tissue， serum lipid four tests， Elisa kits rats CK-MM， CK-MB， TNF alpha， IL-6， IL-18. Results HE staining of myocardial tissue suggested that， compared with the normal group， myocardial cells in the model group and the administration group showed different degrees of vascular congestion， bleeding， interstitial edema and inflammatory cell infiltration， among which the myocardial injury was the least in the high-dose group. The results showed that， compared with the model group， the expressions of TC， TG， hdl-c and ldl-c in the drug administration group and the positive group were decreased （P<0.05）， which was statistically significant. Serum myocardial enzyme results showed that， compared with the model group， the expressions of ck-mm， ck-mb， tnf-alpha， il-6 and il-18 in the normal group and the administration group were significantly reduced （P<0.05）. Conclusion the alcohol extract of iron chopsticks has protective effect on myocardial injury caused by myocardial ischemia in rats， and can improve myocardial blood supply.

Keywords：Tiekuaizi; Myocardial Ischemia; Blood Lipid Four; TNF-α; IL-6;IL-18

心肌缺血（Myocardial ischemia MI）是指由于心脏血液灌注减少，导致心肌供氧减少、心肌能量代谢紊乱，心脏不能正常工作的的一种病理状态，是多种心脏疾病的最初阶段[1]。血压降低，主动脉供血减少，冠状动脉阻塞，血液黏度的改变，心瓣膜病等都可以导致心肌缺血，冠状动脉粥样硬化是造成心肌缺血的主要原因之一，研究還发现治疗血脂与炎症，改善动脉粥样硬化可减少心肌缺血的发生[2]。

根据心肌缺血引起的临床表现，在中医理论体系中可归属于“胸痹”“心悸”范畴，其病位在心，可累及脾肺肝肾诸脏。中医普遍认为，该病症是由于气血阴阳平衡失调所导致，而气血阴阳多由虚所致，虚又是缺血，缺氧之根本，所以病理状态以虚实夹杂，本虚标实多见[3]。随着对“胸痹”“心悸”的历史认识逐渐加深，以及对古代医家疗法的继承以及现代医学的不断发展，关于各种治疗“胸痹”“心悸”的中药复方和中药单分子机制方面研究越来越多。有实验证明由异丙肾上腺素所引起的心肌缺血，通过灌服辛温通阳中药，减轻大鼠心肌缺血的症状，其机制与血清中相关的炎性因子有关。从大量实验及临床观察可以得知[4]，通过研究中药对心肌缺血分子机理的各种调节、影响，可能找到治疗心肌缺血的新方向，为临床治疗心肌缺血提供新思路、新方法。

苗药铁筷子（Helleborus thibetnus Franch.）为腊梅科腊梅属（Chimonanthus）植物腊梅（Chimonanthus praecox L.link.）及山腊梅（Chimonanthus nitens Oliv.）的干燥根，味辛性温，药理研究表明，具有镇痛、理气、活血化瘀的功效[5]，且对于苗族人民，有长期的使用历史，前期实验证明腊梅叶总对心肌缺血具有保护作用[6]，但是铁筷子醇提物对于治疗心肌缺血及保护心肌的实验研究国内外鲜少见到，因此本实验以此为依据模拟现代人高脂高热量饮食引起的冠心病心肌缺血，从血脂及炎症方面进一步探索苗药铁筷子的作用与功效，对民族医药的开发和利用具有一定作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠，体重200～220 g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，（动物合格证编号：SCXK（湘）2014-0011）。

1.2 药品与试剂 铁筷子采自贵阳市乌当区三江镇农场，经贵阳中医学院药学院生药教研室刘晓龙研究员鉴定为腊梅科腊梅属（Chimonanthus）植物腊梅的根;4%多聚甲醛（北京雷根生物技术有限公司，批号：0626-A18）;无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：20180718）;二甲苯（成都高科龙化工试剂厂，批号：2015072801）;HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：20180820）。

1.3 仪器 旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司R-1010）;全自动酶标仪（赛默飞世尔公司 1510）;高速台式冷冻离心机（赛默飞世尔公司Thermo ST16R）;荧光定量 PCR 仪（成都百乐科技有限公司 CFX96TM ）;石蜡切片机（德国莱卡公司RM2245）;包埋机（浙江金华科迪有限公司KD-BM）。

2 方法

2.1 供试品的制备 铁筷子用体积分数为0.78的乙醇热回流提取，减压浓缩，蒸干得浸膏，得膏率约为 13.31%。

2.2 动物造模、分组及给药 36只大鼠除正常组外，其余五组均给予高脂饲料喂养，正常组大鼠用正常饲料喂养（高脂饲料配比为：胆固醇1 %+猪油1 %+蛋黄10 %+丙硫氧嘧啶0.61 %+正常饲料粉78.39 %），高脂饲料喂养2个月后灌胃给药正常组、模型组、阳型组（复方丹参滴丸灌胃（67.5mg/kg））、铁筷子醇提物高（465.5mg/ kg）、中（232.925mg/ kg）、低剂量组（119.615mg/kg），高脂饲料喂养 2 个月后，模型组、阳性组、铁筷子高剂量组、铁筷子中剂量组、铁筷子低剂量组给予腹腔注射维生素 D2（30IU/kg·d），连续腹腔注射7d，正常组给予腹腔注射相同剂量的生理盐水。高脂饲料喂养6个月最后7d，除正常组，其余各组每天给予皮下注射盐酸异丙肾上腺素（5mg/kg·d），正常组给予腹腔注射相同剂量的生理盐水，连续腹腔注射7d。

2.3 检测

2.3.1 病理学检测主动脉及心肌HE染色并对病理损伤评分 动脉粥样硬化造模完成后随机取正常组与模型组进行动脉血管壁检测，最后取材时在腹主动脉取血后，大鼠还有呼吸的状态下，进行心脏的摘取、去毛、腹部及胸部皮肤消毒，沿腹部正中线剪开腹部和胸部皮肤，钝性剥开皮肤及皮下组织， 用眼科剪剪开心包膜，暴露心脏，取下心脏组织，用生理盐水清洗心脏上的血液，将心脏放入装有 4%多聚甲醛的 EP 管中。

2.3.2 心电图检测 用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉（0.75mL/100g），将麻醉后的大鼠仰卧位固定于木板上，并在大鼠四肢内侧皮下平刺插入针灸针，将电极连接在针灸针上，避免其他干扰因素（保证室内处于无风的环境），在系统中选择“循环系统，II导联”，记录并观察好心电图的变化。

2.3.3 血清血脂四项检测 腹主动脉取血，室温下静置30 min后，离心机4000 rpm，15 min离心取上清，分别分装于编号不同的 EP 管中，进行血脂四项检测。

2.3.4 血清心肌酶及细胞因子检测 Elisa试剂盒检测大鼠血清CK-MM，CK-MB，TNF-α、IL-6、IL-18其步骤按照Elisa试剂盒说明书进行。

2.4 统计学分析 所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数加减标准差（x±s）表示，计数资料以频数表示。计量资料的组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 主动脉病理学检查 动脉粥样硬化模型复制完成后，采用随机原则，从正常组及模型组中选取大鼠 HE 染色（80倍）进行主动脉的观察，与正常组相比模型组都有不同程度的脂质沉积、动脉壁增厚及斑块出现，可以认定为动脉粥样硬化造模成功。如图1所示。

3.2 心电图检测 实验最后1天，大鼠皮下注射异丙肾上腺素 30min，在麻醉状态下对大鼠进行心电图检测从心电图（如图2所示）中可以看出，与正常组相比，模型组出现不同程度的 ST 段的改变（ST>0.05mV）（见表1），可以认定心肌缺血造模成功。

3.3 铁筷子醇提物对心肌缺血病理损伤的影响 观察心肌细胞变性、间质水肿、纤维组织增生、血管反应、炎症细胞浸润、出血。上述病变占组织块的 30 %以下+（1分），占 30 %～50 %++（2分），占 50 %以上+++（3分），将所有评分累加即心肌细胞损伤的评分，分级标准为0分为0级，1～3分为1级，4～7分为2级，≥8分为3级。评分结果显示空白组和阳性组 SD 大鼠心肌细胞损伤程度明显轻于其他各组，各组间比较有差异具有统计学意义（P<0.05）;模型组与铁筷子醇提物高、中剂量组比较，心肌细胞损伤明显（P<0.05），但与铁筷子醇提物低剂量组比较差异无统计学意义（P>0.05）;阳性组与铁筷子醇提物低、中剂量组比较差异具有统计学意义（P<0.05），与铁筷子醇提物高剂量组比较差异无统计学意义（P<0.05）。见图3和表2。

3.4 铁筷子醇提物对心肌缺血模型血清血脂四项的影响 6组TG、CHOL、HDL-C、LDL-L各项表达差异有统计学意义（P<0.05）。模型组与正常组、阳性组、高剂量组、中剂量组、低剂量组比较，血脂四项的表达差异有统计学意义（P<0.05），可以认定高脂血症造模成功。与正常組相比，给药组与阳性组的低密度脂蛋白偏高，高密度脂蛋白偏低，与模型组比，阳性组与给药组低密度脂蛋白要低，高密度脂蛋白要高，说明有一定的治疗效果，能降低血脂，但是效果不明显，仍存在血管病变的危险。见表3。

3.5 铁筷子醇提物对大鼠血清心肌酶及细胞因子的影响 模型组与空白组、阳性组、高剂量组、中剂量组、低剂量组比较，血清心肌酶及各炎症因子的表达差异有统计学意义（P<0.05），可以认定高脂血症造模成功;与模型组比，阳性组，铁筷子醇提物高、中、低剂量组均血清CK-MM，CK-MB  TNF-α、IL-6、IL-18明显降低（P<0.05）提示铁筷子醇提物具有心肌保护作用。见表4、表5。

4 讨论

本次实验通过腹腔注射维生素 D2 的目的是造成血管 Ca2+的增加， 从而造成血管内皮的损伤。研究表明，医学界公认为高脂血症是导致动脉粥样硬化一系列心血管疾病的“罪魁祸首”，血浆中所含有的脂质包括胆固醇、甘油三酯等，在正常范围内，这些脂类是人体所必需的营养物质，如果血脂过多，超过正常范围，就能形成脂质代谢紊乱，血液的黏稠度增高，血流速度减慢，脂类代谢物质就会在血管壁内沉积，形成小“斑块”，再加上维生素 D2 的作用，加重的斑块的形成，逐渐堵塞了血管，使得血管管腔狭窄，血液流动不畅。选择盐酸异丙肾上腺素作为心肌缺血的造模药物，盐酸异丙肾上腺素具有强烈的收缩冠状动脉的作用，同时能够增强心肌收缩力并且能够加快心率，从而增加心肌的耗氧量，加强心肌缺血，持续的心肌缺血能够进一步的诱发心肌梗死。所以本实验通过3种造模方式联合模拟心肌缺血而导致的慢性心脏疾病，以便更能贴近临床。动脉粥样硬化造模完成后随机抽取的大鼠主动脉病理切片结果与心电图结果证明本次实验造模成功。

血脂异常是冠状动脉粥样硬化性心脏病的一个重要的危险因素，血浆中脂质在血管壁上的沉积也是发现动脉粥样硬化的必要前提条件。LDL-C 是指血浆中低密度脂蛋白所含的胆固醇，是导致动脉粥样硬化的重要因素;HDL-C 具有抗动脉粥样硬化（AS）的作用，是减少冠心病发生，发展的独立因素，HDL 能够抑制血小板凝聚，促进纤维蛋白溶解的作用，有利于微小血栓的形成，并且可以通过多种方式起到抗血栓作用。甘油三酯（TG）也是血浆中的重要成分，所代谢的极低密度脂蛋白（VLDL）能够被巨噬细胞摄入进入动脉壁，产生直 AS 作用，同时还能促进血栓形成，引起血液的高凝状态，从而增加危险度[7]。本实验结果表明，高脂饲料喂养大鼠，模型组大鼠的 TC、TG、LDL-C 明显升高，HDL-C下降，说明长期的高脂饮食，可以造成血脂的改变。与正常组比较，差异有统计学意义（P<0.05），与模型组比较，各项指标的表达都有一定程度的下降，均有统计学意义（P<0.05），由结果可见，铁筷子醇提物在一定程度上可以起到调节血脂的作用，同时可以通过降低 TG，提高 HDL-C，降低 LDL-C，阻止其氧化，抑制炎症细胞的浸润以及血管内血栓的形成，到达抗 AS 的作用，有效的防止高脂血症这个早期高危因素的形成，从而进一步防止心肌缺血的形成。

肿瘤坏死标志物（TNF）是一种可以直接造成肿瘤细胞死亡的细胞因子，在心血管疾病中起主要作用的是TNF-α[8]，同时，TNF能够直接刺激血管内皮细胞，使其血管的通透性增高，血液中的胆固醇能够很容易的通过血管内膜，而造成胆固醇的沉积，从而形成斑块。而且细胞受损，内膜的增厚，也能促进动脉粥样硬化的形成，进而加重心肌缺血，因此，TNF 被认为是冠状动脉内皮功能紊乱以及内膜增厚的主要原因[9]。IL-6又被称为前炎症细胞因子，在细胞因子介导的炎症反应中与AS形成的早期阶段有着重要作用[10]，IL-6能够侵蚀斑块内部的基质，能造成斑块的破裂，并且血清中 IL-6浓度越高，发生心肌缺血以及心绞痛的风险也就越高，是健康人将来发生心肌梗塞的危险性的预测因子。无论是心肌缺血还是心肌梗塞等其他心血管疾病，IL-6的水平都是升高，进一步说明 IL-6与心血管疾病密切相关[11]。IL-18是炎症反应中重要的调节因子，并且是炎症疾病的重要介质，在炎性反应中发挥着重要的作用，血清中 IL-18水平的升高， 能够引起动脉斑块的不稳定性。并且有相关研究证实，血清 IL-18水平的升高，甚至有可能导致斑块的破裂，说明 IL-18或许可以对冠心病患者的发生及发展存在的因果关系[12]。

CK-MM、CK-MB 都是评价心肌缺血损伤程度的重要指标。CK-MB、CK-MM 主要分布于骨骼肌和心肌中，在各种酶中是最早进入血液中的，其分子量小，所以分布量广，数量多，所以是心肌缺血时血清酶最早升高的一类。有文献表明，当患者发生急性心肌梗死时，CK-MM、CK-MB 都会超过正常水平，异常升高，尤其是 CK-MB。心肌梗死时 CK-MB 保持着高水平，有文献指出，心绞痛时血清中 CK-MB 也会表现出高水平，因此将 CK-MM、 CK-MB 视为诊断急性心肌梗死的“金标准”[13-14]。

本实验结果表明，模型组与正常组相比，模型组血清TNF-α、IL-6、IL-18 显著升高，铁筷子醇提物高、中、低剂量组与模型组比较，铁筷子高剂量组血清 TNF-α 水平明显降低（P<0.05），中剂量与低剂量血清 TNF-α 水平有下降，其中低剂量下降差异无统计学意义（P>0.05），说明铁筷子醇提物能够降低血清 TNF-α 的水平，能够抑制炎性因子的表达，起到抗炎作用，对心肌缺血具有一定的保护作用，其中高剂量效果最为明显。模型组中心肌酶 CK-MM、CK-MB、LDH 三項指标与正常组比显著升高（P<0.05），说明 ISO 可以导致心肌细胞的损伤，提示心肌缺血模型制备可靠。铁筷子醇提物高、中、低剂量组中 CK-MM，CK-MB 指标均低于模型组（P<0.05），证明一定剂量的铁筷子醇提物能够对心肌起到保护作用。

参考文献

[1]Prunier F， Angoulvant D， Etienne C S， et al. The RIPOST-MI study， assessing remote ischemic perconditioning alone or in combination with local ischemic postconditioning in ST-segment elevation myocardial infarction[J]. Basic Research in Cardiology， 2014， 109（2）：400.

[2]Wawrzyniak A J. Framingham Heart Study[J]. Journal of Clinical Lipidology， 2011， 5（5）：335.

[3]谢昂，王凤荣.胸痹心痛病名与病机[J].实用中医内科杂志，2013，27（6）：160-165.

[4]赵艺.张仲景“通阳宣痹”治法研究[D].哈尔滨：黑龙江中医药大学，2014.

[5]孙鑫，王西芳.铁筷子的药理及质量相关性研究[D].咸阳：陕西中医药大学，2013.

[6]Tsang A， Hausenloy D J， Mocanu M M， et al. Postconditioning： a form of "modified reperfusion" protects the myocardium by activating the phosphatidylinositol 3-kinase-Akt pathway[J]. Circulation Research， 2004， 95（3）：230-232.

[7]韦永芳， 刘寒英， 严艳花，等. 紫薯花色苷提取物对ApoE～（-/-）小鼠动脉粥样硬化和高脂血症的作用[J]. 中国病理生理杂志， 2018， 34（12）：173-178.

[8]蔡银链，许朝祥，王耀国，等.白藜芦醇通过抑制TNF-α的释放缓解大鼠缺血再灌注心脏损伤[J].免疫学杂志，2018，34（11）：934-939.

[9]邵杉， 胡司淦， 卢冬雨，等. TNF-α和IL-6水平与不同类型冠心病的相关性研究[J]. 中华全科医学， 2011， 9（9）：1355-1356.

[10]常厦云，朱凌鹏，王秋娟，等.红景天苷对异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌缺血的影响[J].中药药理与临床，2016，32（2）：67-70.

[11]WU C Y， WU Z G， YU G Y. Detection of Traditional Myocardial Enzymes Clinical Significance in the Diagnosis of Acute Myocardial Infarction （AMI）[J]. Chinese Journal of Medicinal Guide， 2013.

[12]易军. 白细胞介素-8对缺血心肌血管新生的影响及其机制研究[D]. 长沙：中南大学， 2014.

[13]雷升萍，龙子江，施慧，等.黄精多糖对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用[J].中药药理与临床，2017，33（1）：102-106.

[14]邱久文， 李志強， 王红颖， 等. 大株红景天注射液抗大鼠急性心肌缺血作用[J]. 中国现代中药， 2018， 20（10）：58-62.

（收稿日期：2019-08-27 编辑：程鹏飞）