民族药材大菟丝子中绿原酸含量的测定

赵光远 李强 靖彩霞 魏颖轩 张鸿沛

【摘 要】 目的：采用高效液相色谱法对民族药材大菟丝子中绿原酸含量进行测定并开展方法学研究;方法：以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）为流动相，等度洗脱，流速1.0mL/min，检测波长327nm，采用C18色谱柱，柱温30℃，外标法定量。结果：绿原酸在0.5275～105.5μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=0.9994），平均回收率为99.2%（RSD=0.5%）。结论：测定方法快速、简便，符合方法验证要求，可用于大菟丝子中绿原酸含量的测定和质量控制。

【关键词】 大菟丝子;高效液相色谱法（HPLC）;绿原酸;含量

【中图分类号】R284.1 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）22-0043-03

Determination of Chlorogenic Acid in Ethnic Medicines Cuscuta Japonica Choisy

ZHAO Guangyuan LI Qiang JING Caixia WEI Yingxuan ZHANG Hongpei

BaoTou Food and Drug Inspection & Testing Center， Baotou 014060， China

Abstract：Objective Establish a method for determination of chlorogenic acid in Cuscuta Japonica Choisy with HPLC. Methods The mobile phase was consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid aqueous solution （10∶90）， The flow rate was 1.0 mL/ min， the detective wavelength was 327 nm and the C18 column temperature was 30℃.With external standard method to make quantitative analysis.Results The linear range of the method was 0.5275 ～105.5μg/mL， the average recovery was 99.2%，RSD was 0.5%. Conclusion This method is simple， fast and efficient， which will be used to provide accurate， scientific quality control for determination of chlorogenic acid in Cuscuta Japonica Choisy.

Keywords：Cuscuta Japonica Choisy; HPLC; Chlorogenic acid; Content Determination

大菟絲子Cuscuta japonica Choisy.又名日本菟丝子，为旋花科菟丝子属植物金灯藤的干燥成熟种子。秋季果实成熟时采收植株，晒干，打下种子，除去杂质，即可，为少数民族药材，不得代替菟丝子，药用时应分别入药[1]。《内蒙古中药材标准》（1988年版）和《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003年版）均收载该品种，大菟丝子性辛、甘、平，具有补肝肾、益精髓、明目的作用，可用于腰膝酸痛、遗精、消渴、目暗、尿频、淋沥。《内蒙古中药材标准》中收录大菟丝子质量标准仅制定了[性状]和[检查]项[1]，《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录的大菟丝子也缺少指标成分作为含量控制项目[2]，根据文献报道[3-4]，大菟丝子含黄酮类化合物、甾类化合物和有机酸等，有机酸主要含有咖啡酸和绿原酸，其中绿原酸具有抗病毒、保肝利胆作用。瞿燕等[4]利用HPLC 法建立了大菟丝子生品和炮制品的特征图谱，探讨大菟丝子炮制前后化学成分的变化规律，并未对大菟丝子中绿原酸含量测定方法做系统性研究。冯华等[5]对黔产大菟丝子中绿原酸含量进行了测定，样本收集仅限于贵州地区，而大菟丝子分布于我国南北各省，越南、朝鲜、日本也有[6]。本实验采用高效液相色谱法对国内不同产地及韩国、朝鲜的9批次大菟丝子中的绿原酸含量进行测定，考察不同产地大菟丝子中绿原酸的含量差异，为提高和完善大菟丝子的质量标准提供参考依据。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，PDA检测器;岛津UV-2450紫外分光光度计;KQ5200DE型数控超声波清洗器。

绿原酸对照品（批号：110753-201716;中国食品药品检定研究院）;大菟丝子为包头市食品药品检验检测中心收集制备并确定基源。乙腈为色谱纯;水为高纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 采用SHIMADZU  VP-ODS色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），以乙腈-0.05%磷酸溶液（10∶90）为流动相进行流动相条件摸索，流速1.0mL/min，柱温30℃，进样量10μL。绿原酸峰的理论塔板数均大于7000，与相邻杂质峰的分离度均大于1.5。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取绿原酸对照品10.55mg，置50mL容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，精密量取上述溶液10mL置100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得浓度为21.10μg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取大菟丝子粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，超声处理（功率200W，频率40kHz）30min，放冷，再称定重量，用甲醇水混合溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 采集波长的确定 取对照品溶液置于紫外分光光度计上，在210～350 nm波长范围扫描。结果表明绿原酸在327 nm的波长处有最大吸收，故选择327 nm作为其含量测定的检测波长，后续方法学考察结果也表明在该波长下测定数据稳定、可靠。典型色谱图如图1和图 2所示。

2.4 线性关系考察 准确称取绿原酸对照品10.55mg，置50mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为储备液（211.0μg/mL），分别精密量取储备液0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、1mL、1mL、2mL、2.5mL置200mL、100mL、100mL、50mL、10mL、5mL、5mL、5mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，得到系列浓度见表2，分别测定，以峰面积为纵坐标，绿原酸浓度为横坐标，进行回归分析，回归方程为：y =34310x-38873 （x为浓度，y为峰面积） r=0.9994。绿原酸在0.5～105μg/mL范围内线性关系良好，结果见表2。

2.5 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液（浓度为21.10μg/mL）10μL，注入高效液相色谱仪， 按“2.1” 项下色谱条件连续进样6次， 记录绿原酸图谱， 绿原酸平均峰面积值为655031，RSD为0.3%。表明方法的精密度良好。

2.6 稳定性考察 取同一份供试品溶液，过滤后室温放置，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后按2.1中的色谱条件进行测定，试验结果见表3，放置不同时间的峰面积RSD为0.2%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验 称取同一供试品6份，分别照2.2.2处理并测定绿原酸含量，6份供试品绿原酸平均含量为0.1772%，RSD为0.6%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取已测定含量（含量0.1772%） 的同一供试品6份，每份约0.25 g，精密称定，分别置6个具塞锥形瓶中，各精密加入浓度为180.0μg/mL的绿原酸对照品溶液各2.50mL及50%甲醇溶液47.5mL，按2.2.2中供试品处理方法进行处理并测定含量，结果见表4，绿原酸的平均回收率（n=6）为99.2%，RSD=0.5%，表明该方法回收率良好。

3 样品含量测定

取9批材大菟丝子，分别按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1方法测定绿原酸含量（以干基计）。结果见表5。

4 讨论

选用甲醇和水溶混合溶剂剂提取，分别考察15 min、30 min、45 min不同超声提取时间对提取效率的影响，结果发现超声提取30min，绿原酸已经基本提取完全;在提取过程中，改变甲醇-水比例（25%、50%、75%）进行提取溶剂比例的考察，发现以50%甲醇的提取效果较为理想。

通过对9个不同产地大菟丝子中绿原酸含量测定发现：绿原酸含量最高的为0.7789%（7号样，河南），含量最低的为0.1786%（4号样，云南），不同产地的大菟丝子中绿原酸的含量差异明显，相差4倍多，制定相应质量指标限度时需要进一步考察多产地药材数据结果。中药材中绿原酸含量测定方法中多以磷酸调节流动相酸度[7]，在方法制定及9批大菟丝子中绿原酸含量测定实验过程中发现，使用磷酸调节流动相酸度时，浓度不宜过高，流动相pH值过低容易造成色谱柱固定相的水解流失，引起柱效下降甚至损坏[8]，在满足要求的前提下尽量降低使用浓度，因此，本方法流动相采用的磷酸溶液浓度为0.05%，其pH值为2.2，满足实验要求的同时也不会对色谱柱造成損坏。

综上结果表明本法可靠，准确度高、重复性好，对色谱柱破坏小，可作为大菟丝子中绿原酸含量的分析方法，同时9批大兔丝子中绿原酸含量的测定结果也为相应标准中指标成分的限度制定提供参考数据。

参考文献

[1]内蒙古自治区卫生厅编.内蒙古中药材标准（第二册）[M].呼和浩特：内蒙古自治区卫生厅，1988：47.

[2]贵州省食品药品监督管理局编.贵州省中药材、民族药材质量标准[S].贵阳：贵州科技出版社，2003：39.

[3]郭澄，王雅君，张剑萍.菟丝子的化学成分和药理活性研究[J].时珍国医国药，2005，16（10）：1035-1036.

[4]瞿燕，李琼，魏文龙，等.大菟丝子生品和盐炙品HPLC-UV特征图谱及7个有机酸含量变化研究[J].药物分析杂志，2014，34（5）：824-829.

[5]冯华，石尚友，罗秀琼，等黔产大菟丝子中绿原酸的定性与定量分析，中国民族民间医药2017，26（5）：14-16.

[6]欧恒熙.大菟丝子炮制工艺和质量标准研究[D].贵阳：贵阳医学院，2013.

[7]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2015：30，54.

[8]中国药品生物制品鉴定所.中国药品检验标准操作规范（2010年版）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：90.

（收稿日期：2019-09-10 编辑：刘 斌）