黄芩提取物抗紫外辐射作用的体外研究

李娜坤，王雪萌，刘黎瑶,,通信作者，王庆奎



黄芩提取物抗紫外辐射作用的体外研究

李娜坤a，王雪萌a，刘黎瑶a,b,通信作者，王庆奎b

（天津农学院a. 基础科学学院，b. 天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

某些中药提取物含有的黄酮类有效成分，对于紫外线具有广谱吸收能力，能够清除紫外辐射所诱导产生的活性氧自由基，从而发挥辐射保护作用。本研究中，利用超声提取法得到黄芩提取物，测定了总黄酮类有效物质的含量，通过紫外全波长扫描，确认该提取物具有吸收紫外辐射的效果。研究了不同质量浓度黄芩提取物对于活性氧化自由基——羟基自由基以及超氧阴离子的清除作用，并以大肠杆菌作为模型菌体进行了体外辐射试验，证实了黄芩总黄酮提物具有抗紫外辐射的作用，且该作用具有剂量依赖性。

黄芩提取物；抗紫外辐射；清除自由基；体外研究

1 仪器与试剂

1.1 仪器

电子天平（Sartorius，BSA 223S）；超声波清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司，SB-5200DT型）；紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；低速离心机（长沙湘仪仪器有限公司，L550）；超净工作台（苏净基团苏州安泰空气技术有限公司，SW-CJ-2FD）；高速粉碎机、恒温水浴锅等。

1.2 试药和试剂

中药黄芩饮片（购于北京同仁堂大药房，产地：内蒙古）；芦丁标准品（中国药品生物制品检定院，HPLC≥98%）；无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂，分析纯）；水杨酸、硫酸亚铁、氢氧化钠、氯化钠（天津市风船化学试剂有限公司，分析纯）；三羟甲基氨基甲烷（源叶生物，分析纯）；邻苯三酚（北京索莱宝科技有限公司，分析纯）；其他试剂均为生物试剂级别。

1.3 试验菌株

大肠杆菌由天津农学院基础科学学院生物制药实验室提供。

2 试验方法

2.1 黄芩总黄酮提取物的提取方法

称取适量中药黄芩，洗净并干燥至恒重，用高速粉碎机粉碎，过60目筛。参考文献[4]中的方法，在辅助加热条件下对黄芩细粉进行超声提取。具体提取方法为：称取30 g黄芩细粉置于250 mL三角瓶中，向其中加入100 mL 体积分数为70%的乙醇，在60 ℃水浴条件下进行超声提取45 min，放凉至室温，用滤纸过滤，取滤液，于4 000 r/min条件下离心20 min，对上清液进行水浴加热浓缩，至提取物质量浓度约为1 g/mL，作为黄芩提取物浸膏液，密封置于4 ℃条件下，备用。

2.2 紫外全波长扫描

田笑着开车走了，车子带起的秋风把女人推了一下，使她立马就打了个冷战。她一边裹紧了风衣朝前走，一边想看来只能单身一辈子了。

2.3 黄芩提取物中总黄酮含量的测定[5]

2.3.1 芦丁标准曲线的绘制

精密称定10 mg芦丁对照品置于容量瓶中，加无水乙醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL储备液。吸取适量储备液稀释，配制成质量浓度为2、4、6、8、10 μg/mL的系列标准溶液。按紫外分光光度法，测定不同质量浓度芦丁系列溶液在260 nm处的吸光度。以对照品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

2.3.2 精密度试验

取芦丁对照品系列溶液，通过紫外分光光度法，测定其在260 nm处的吸光度，连续重复测定5次，记录吸光度数值，并计算值。

2.3.3 加样回收率试验

称取适量已经确定总黄酮含量的黄芩提取物，量取适量的芦丁标准品储备液加至其中，使芦丁对照品最终质量浓度分别为2、6、10 μg/mL（＝3）。经微孔滤膜过滤之后，取续滤液，按紫外分光光度法，测定其在260 nm处的吸光度，计算对照品的加样回收率。

基于在短时间内“云动雪不变”的假设，即云层在不断运动，观测值随时间变化，而积雪相对固定，一段时间内不会变化.选取一定时间段内同一区域的多幅高分四号全色图像，采用以上方式提取具有高反射值的云雪覆盖区.按照短时间内“云动雪不变”的思想，同一处位置的像元在每个时相影像中均被检测出是云雪，则会被进一步确认为是不变的积雪像元，否则就认为是由于运动云层造成的亮像元而予以去除.通过对多时相高分四号卫星云雪监测范围进行累计合成运算，能尽可能消除移动云层的影响，将各个时相上均被识别为雪的区域作为积雪覆盖范围.

称取1 g黄芩提取物浸膏液，加蒸馏水稀释至10 μg/mL，经微孔滤膜过滤后，用紫外-可见分光光度计测定续滤液在200～400 nm波长下紫外吸收情况，并记录该波段的扫描光谱图。

当车轮以很高的速度沿钢轨滚动时，它受到的轮轨作用力是一个沿其滚动圆高速移动的荷载。这个相对车轮快速旋转的作用力不但包含一个静力成分，即一半的轴荷载，同时也包含许多由于轮轨相互作用而产生的高频成分，其频率高达4～5 kHz。移动荷载会给车轮产生波动效应，同时，车轮的旋转会引入离心和陀螺效应。可以设想，高速旋转车轮的动力学特性一定不同于非旋转车轮的动力学特性，而且前者比后者更复杂。

2.4 自由基清除试验

2.4.1 羟基自由基（·OH）清除试验

量取适量黄芩提取物浸膏至容量瓶中，用无水乙醇稀释定容。经微孔滤膜过滤之后，通过紫外分光光度法，测定续滤液在波长260 nm下的吸光度，利用标准曲线的回归方程，计算黄芩提取物中总黄酮含量。

对动物常见疫病进行分析，有利于进一步提升动物疫病防治工作的整体开展水平，有效保证我国畜牧养殖事业整体开展水平。由于我国动物疫病监测工作起步较晚，大部分监测技术和方式应用还不完善，监测人员通常需要在应用规范监测方式的基础上结合自身经验，这种形势对我国动物疫病监测工作的高质量进行造成阻碍，同时也降低了疫病监测的准确率[1]。因此，监测机构和工作人员有必要分析和总结动物常见疫病，首先应明确动物疫病监测中常见疫病，进行动物疫病监测中常见疫病分析，主要可将研究内容归纳为动物疫病监测中常见疫病以及动物疫病监测常见疫病的诱因2方面，具体研究内容总结归纳如下。

利用Fenton反应产生·OH体外试验模型[6-8]，研究不同质量浓度的黄芩提取物清除·OH的作用。具体试验方法为：首先，设置3个黄芩提取物浓度组（10、50以及100 mg/mL），依次加入0.75 mL 8 mmol/L水杨酸钠溶液、1.0 mL 6 mmol/L硫酸亚铁溶液以及0.5 mL各质量浓度的样品溶液，最后向试管中加入0.75 mL 24 mmol/L过氧化氢溶液启动反应。将上述反应体系置于37 ℃水浴条件下，避光孵育60 min，测定其在510 nm处的吸光度。每质量浓度设3组平行试验，以蒸馏水作为空白对照。通过公式（1）计算·OH的体外清除率。

清除率（%）＝[空白-（样品-本底）] /空白×100（1）

其中，空白为空白对照组的吸光度；样品为加入样品溶液后的吸光度；本底为未加入显色剂过氧化氢时药物溶液本底的吸光度。

四是做好培训工作。做好对博士后、研究团队、应用单位技术人员的培训，提升研究、应用、转化能力，构建智力开发与传播平台，以提升应用转化成果的能力，扩大影响、加快成果传播、创造转化机会。

清除率（%）＝（空白-样品）/空白×100（2）

其中，空白为空白对照组的吸光度；样品为加入样品溶液后的吸光度

2.5 体外菌体辐射试验[11-12]

在无菌操作条件下，取处于对数生长期的大肠杆菌，加入适量灭菌生理盐水制备成大肠杆菌悬液。取无菌试管，分别向其中依次加入1 mL大肠杆菌悬液以及1 mL各质量浓度的样品溶液，振摇混匀后，分别移取100 μL菌悬液进行细胞计数，记录总菌数。将上述试管接受紫外照射，照射时长为30 s。用灭菌蒸馏水代替样品溶液作为空白对照组。紫外辐射结束后，再移取100 μL菌悬液至细胞计数板上，滴加1滴0.02%亚甲蓝染色，能够被亚甲蓝染成蓝色的细胞即为死亡细胞。通过公式（3）计算大肠杆菌存活率。

大肠杆菌存活率（%）＝（活菌数量/总菌数）×100（3）

3 结果与分析

3.1 紫外全波长扫描结果

3.2.3 加样回收率测定试验

图1 黄芩提取物的紫外全波长扫描图谱

3.2 黄芩提取物中总黄酮含量的测定

3.2.1 芦丁标准曲线

按既定试验方法，用紫外分光光度法对芦丁标准品系列溶液进行测定。结果表明：以吸光度（纵坐标，）对质量浓度（μg/mL，横坐标，）进行线性回归，回归方程为＝0.079 8- 0.008 3（2＝0.999 7）。线性测定结果（如图2所示）表明：在既定测定方法下，芦丁标准品系列溶液在质量浓度2～10 μg/mL范围内线性关系良好。

图2 芦丁标准品系列溶液标准曲线

3.2.2 精密度试验

那日本兵又骂一声八嘎，准备再给周教授两耳光。鬼子军官挥手制止了。鬼子军官背着手沿周教授走了一圈儿，又沿五个人走了一圈儿，最后面对着几个站定，用生硬的中国话说，你们的，什么的干活？

2.3.4 黄芩提取物中总黄酮含量测定

按既定试验方法，系列芦丁标准品溶液精密度测定结果如表1所示。表1表明，分别对低、中、高质量浓度对照品溶液连续重复5次测定，值均小于2%，表明本法的精密度良好。

表1 精密度试验结果

注：表中表示吸光度；表示标准偏差；表示相对标准偏差

按既定试验方法，对得到的黄芩提取物溶液进行紫外全波长扫描，结果如图1所示。扫描结果表明：黄芩提取物（10 μg/mL，按提取物质量浓度计）在200～400 nm处具有较强的紫外吸收能力，在200 nm附近以及260 nm处均表现出较强的紫外吸收峰。

芦丁对照品回收率测定结果如表2所示。结果表明，在既定测定方法下，低、中、高质量浓度样品回收率均大于95%，且平均回收率的值均小于2%，表明既定测定方法的回收率合格。

表2 加样回收率测定结果

3.2.4 提取物中总黄酮含量测定

黄芩提取物中总黄酮含量测定结果表明，对中药黄芩细粉进行超声提取，醇提物中总黄酮含量为20.41 mg/mL。

常爱兰嫁到我们岭北周村的第二年，麻糍就死了。麻糍死的第二年，常爱兰又嫁了。常爱兰嫁给驮子时，周小羽十岁。

3.3 自由基清除试验

3.3.1 羟基自由基（·OH）清除试验

妇幼保健档案管理现代化水平的提高需要做好以下两个方面工作:一方面,增强档案管理人员技术水平,重视对新技术、新手段的应用;另一方面,加大在妇幼保健档案管理硬件方面投入力度,做好各项基础设施建设,提高先进档案管理技术应用有效性,使档案管理数字化和信息化水平得到有效提高。

按既定试验方法，研究不同质量浓度的黄芩提取物体外清除·OH的效果，结果如表3所示。表3表明，在所设定的低、中、高质量浓度下，黄芩提取物均具有清除·OH的效果，且清除效率具有剂量依赖性。随着提取物质量浓度的升高，黄芩提取物对于·OH的体外清除率也随之升高。在提取物质量浓度为100 mg/mL时，对·OH的体外清除率接近80%。

表3 体外•OH清除试验结果

表4 体外O清除试验结果

3.4 体外菌体辐射试验

低、中、高质量浓度的黄芩提取物对于菌体的抗辐射能力，如图3所示。图3表明：经紫外辐射30 s后，空白对照组中大肠杆菌存活率约为20%，而加药组中的存活量明显升高，约为45%～75%，表明黄芩提取物具有抗紫外辐射作用，并且随着提取物质量浓度的升高，对菌体的保护作用增强。

21日上午，中国铁路太原局集团有限公司与山西省旅游发展委员会联合主办了“山西全域旅游铁路行”推介会，启动“山西全域旅游铁路行”，加快铁路客运供给侧结构性改革，推动山西全域旅游融合发展。

总而言之，写作离不开实践，教师若想提高学生的综合写作能力，一定不能操之过急，这是漫长的过程。在平时的教学中，教师应培养学生用心感受生活，细致观察生活中发生的小事情，从而有所感悟。学生也应当注重与周边人相处时心灵的触动，同时教师也应时常给予学生自信，激发学生对作文写作的积极性，最后从根本上提升学生的综合成绩与阅读水平。

图3 体外菌体辐射保护试验

4 讨论

在提取中药黄酮类成分时，一般会使用渗漉法、回流法、超声提取法、微波提取法等多种方法[13-15]。根据相关文献[4]，本研究采用超声提取法提取黄芩提取物，该法具有简便易行的特点，可缩短提取时间，提高提取效率，同时，能避免高温条件对于黄酮类有效成分的破坏。据前期研究结果可知，中药药材的粉碎粒度对其中有效成分的提取具有一定影响，药材粉碎程度越大、粒度越小，更有助于提高有效成分的提取效率。因此，本研究中黄芩以细粉的形式进行超声提取。测定结果表明在该条件下，黄芩提取物中总黄酮类有效成分的含量较高。

[1] 章玲玲，许爱娥. 天然植物提取物抗紫外线损伤的作用[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2015，14（6）：400-402.

[2] 杨汝斌，万屏，刘玲. 植物提取物抗光老化研究进展[J]. 中国皮肤性病学杂志，2011，25（4）：309-311.

[3] 陈莉，张蓓. 植物染料黄芩的化学成分及其防紫外线性能[J]. 纺织学报，2016，37（4）：86-90.

[4] 项昭保，赵顺，何从林，等. 黄芩总黄酮超声提取工艺研究[J]. 食品工业科技，2013，34（13）：202-204.

[5] 王红茜，凡苗振，邹琴，等. 黄芩总黄酮提取物乳膏剂的处方工艺研究[J]. 天津农学院学报，2017，24（4）：33-37.

[6] Orthen B，Popp M，Smirnoff N. Hydroxyl radical scavenging properties of cyclitols[J]. Proceedings of the Royal Society of Edinburgh，1993，102（5）：227-231.

[7] 颜军，苟小军，邹全付，等. 分光光度法测定Fenton反应产生的羟基自由基[J]. 成都大学学报（自然科学版），2009，28（2）：91-93.

[8] 杨芬，张瑞萍，贺玖明，等. 羟自由基的产生、捕集及检测方法[J]. 药学学报，2007，42（7）：692-697.

[9] 曹玉娜，宋志前，魏征，等. 抗氧化剂的抗氧化活性测定方法研究进展[J]. 中国药房，2013，24（1）：86-88.

[10] 韩少华，朱靖博，王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造，2009，28（6）：155-157.

[11] 王鹏，江晓路，江艳华，等. 系列海洋特征性寡糖抗紫外辐射构效关系研究[J]. 天然产物研究与开发，2011，23（5）：874-877.

[12] 陈沙，张凤英，罗秋水，等. 越橘抗紫外线和微波辐射作用的研究[J]. 中国食品学报，2012，12（1）：124-129.

[13] 张红医，赵淑军，成谦，等. 中药黄芩提取方法的优化[J]. 河北大学学报（自然科学版），2006，26（4）：390-395.

[14] 周德庆，曾骆. 黄芩总黄酮的提取工艺研究[J]. 华西药学杂志，2003，18（1）：78-79.

[15] 张芳，郭庆梅，张永清. 离子液体-微波辅助提取黄芩饮片中四种黄酮类成分[J]. 天然产物研究与开发，2014，26（12）：1971-1976.

[16] 刘满红，杨明惠，刘晓芳，等. 紫外辐射诱发自由基体系及抗氧化活性的研究[J]. 化学世界，2008，49（1）：14-16.

责任编辑：宗淑萍

Investigation of anti-ultraviolet radiation effect of extracts fromGeorgi

LI Na-kuna, WANG Xue-menga, LIU Li-yaoa,b, Corresponding Author, WANG Qing-kuib

（Tianjin Agricultural University, a. College of Basic Science, b. Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

Flavonoids effective components, which possess anti-ultraviolet radiation effect through absorbing a broad spectrum of ultraviolet radiation and eliminating reactive oxygen species induced by ultraviolet radiation, are abundant in extracts from some Chinese medicine. Thus, in this investigation, ethanol extracts were acquired firstly through ultrasonic method and total flavonoid content was measured. On the basis of full wave scanning in ultraviolet area, absorptive effect of ultraviolet radiation was confirmed for ethanol extracts. Afterwards, eliminative effects of hydroxyl free radical and superoxide anion were studied andanti-ultraviolet experiments were established usingas model bacteria. Through this investigation, it was confirmed that ethanol extracts fromGeorgi do have anti-ultraviolet radiation effect and this effect is dose dependent.

Georgi extracts; anti-ultraviolet effect; elimination of free radicals;studies

1008-5394（2018）04-0063-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.014

P641.131；S152.72

A

2018-05-21

天津市教委科研计划项目（2017KJ181）；天津市水产产业技术体系创新团队项目（ITTFRS2017004）

李娜坤（1996-），女，本科在读，研究方向：中药新剂型研究。E-mail: 784249285@qq.com。

刘黎瑶（1988-），女，讲师，博士，主要从事药物制剂方面的研究。E-mail: llymeilin@163.com。