异甘草酸镁注射液联合紫杉醇诱导乳腺癌细胞株凋亡及其机制

徐君南，李美静，李晓睿，高志超，孙涛

乳腺癌是引起全世界范围内女性肿瘤相关死亡的主要原因之一。近年来，大量治疗乳腺癌的化疗、内分泌和靶向药物问世，显著改善乳腺癌病人的生存预后。然而不幸的是绝大多数乳腺癌的病人最终往往对化疗药物耐受，从而导致治疗失败甚至死亡[1]。化疗仍是乳腺癌治疗的基石，如何提高化疗药物的抗肿瘤作用是临床医师的研究重点。紫杉醇是继蒽环类药物之后为乳腺癌病人治疗的基石化疗药物，但体外研究表明药物外排蛋白高表达或者乳腺癌干细胞等均可导致紫杉醇耐药[2-3]。异甘草酸镁(magnesium isoglycyrrhizinate，MGL)作为甘草酸的一种立体异构体，主要由天然甘草提取并碱化后制成镁盐形式，其生物学活性包括抗炎、肝保护、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分临床前及临床研究表明异甘草酸镁有一定抗肿瘤活性[5]，然而其对于乳腺癌细胞的影响及确切的作用机制尚不明确。本研究基于此，研究异甘草酸镁单药及联合紫杉醇诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡作用，并探讨其分子机制。

1 材料与方法

1.1材料本研究于辽宁省乳腺癌重点实验室自2016年3月至2017年1月进行，乳腺癌细胞株MCF-7(购自中国科学院上海细胞库)。异甘草酸镁注射液(正大天晴药业集团股份有限公司，生产批号160115104)，紫杉醇(百时美施贵宝有限公司，生产批号3L01986)由提供。β-actin抗体、pBcl-2单抗、Notch2单抗、Caspase-3多抗均购自于Abcam公司和CST公司。辣根过氧化物酶-结合抗兔的二抗、CCK-8试剂盒和增强化学发光溶液购自于上海碧云天生物技术有限公司。AnnexinV-FITC/PI凋亡试剂盒购于BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 乳腺癌细胞株MCF-7置于含10%胎牛血清、l×108U/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM(高糖型)培养基中。调整细胞密度为105/mL置于培养瓶中，37 ℃、5%CO2的恒温细胞孵育箱中连续培养。

1.2.2CCK-8法测细胞抑制 将细胞密度为5×104/mL-1MCF-7细胞接种在96孔培养板中，加入不同浓度的异甘草酸镁注射液(0、0.1、0.3、1、3、10、30、100、300、1 000) μmol/L和10 μmol/L紫杉醇培养48 h，其加入CCK8反应液10 μL，4 h后在酶标仪波长为490 mm处测定各孔的光吸收值(OD值)，计算细胞增殖抑制率，实验每组重复至少3次。

1.2.3流式细胞仪检测凋亡率 设定阴性空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组、异甘草酸镁注射液联合紫杉醇(联合)组四组，细胞24 h后收集，并加500 μL结合缓冲液再加5 μL 磷脂酰丝氨酸蛋白抗体(AnnexinV-FITC) 和5 μL 碘化丙啶(Propidium iodide，PI)试剂分别混合，室温反应15 min。采用流式细胞仪测定不同组别的细胞早期凋亡和晚期凋亡情况。

1.2.4蛋白印迹法(Western Blot)检测蛋白表达设定阴性空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组、异甘草酸镁注射液联合紫杉醇组四组，收集药物处理24 h的蛋白，提取总蛋白并测定其浓度，采用Western Blot分别检测β-肌动蛋白(β-actin)、磷酸化B淋巴细胞瘤-2基因(phosphate-B-cell lymphoma-2，pBcl-2)、半胱天冬酶 (cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)-3以及缺口蛋白(Notch)通路Notch2蛋白表达情况。

2 结果

2.1异甘草酸镁注射液、紫杉醇对MCF-7细胞的体外增殖抑制作用CCK8法检测结果显示：浓度在0.1～100 μmol/L之间的异甘草酸镁注射液对MCF-7细胞的增殖抑制作用随着药物浓度的升高而增强，之后略有下降，在100 μmol/L达到最高峰，详见图1。不同浓度的异甘草酸镁注射液联合紫杉醇的CCK8检测结果显示：与单药组对比，两药联合组有较高的细胞增殖抑制率，尤其在100 μmol/L(60.89% 比 26.98%，t=-0.017，P<0.05)，两药相互作用指数q值分别为1.987，显示异甘草酸镁注射液联合紫杉醇对乳腺癌MCF-7细胞的抑制具有一定协同作用。

图1 不同浓度异甘草酸镁注射液及联合紫杉醇干预MCF-7细胞增殖抑制情况

2.2异甘草酸镁注射液联合紫杉醇促进MCF-7细胞凋亡AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞技术检测结果显示：空白对照组，100 μmol/L异甘草酸镁、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L异甘草酸镁联合10 μmol/L紫杉醇联合组与MCF-7细胞的早期凋亡率差异有统计学意义(F=209.839，P<0.001)，且与空白对照组相比，100 μmol/L异甘草酸镁、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L异甘草酸镁联合10 μmol/L紫杉醇联合组的早期凋亡率更高(均P<0.001)。空白对照组，100 μmol/L异甘草酸镁、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L异甘草酸镁联合10 μmol/L紫杉醇联合组与MCF-7细胞的晚期凋亡率差异有统计学意义(F=40.742，P<0.001)。与单药组相比，100 μmol/L异甘草酸镁、10 μmol/L紫杉醇、100 μmol/L异甘草酸镁联合10 μmol/L紫杉醇联合组显著增加MCF-7细胞的晚期凋亡率(均P<0.001)。见表1和图2。

表1 异甘草酸镁注射液、紫杉醇及联合干预MCF-7细胞24 h的凋亡情况/(%，±s)

图2 异甘草酸镁注射液、紫杉醇及联合组干预MCF-7细胞24 h的细胞流式图

图3 异甘草酸镁注射液、紫杉醇及联合组干预MCF-7细胞pBcl-2、Caspase-3和Notch2表达：A为pBcl-2、caspase-3和b-actin的Western Blot代表性条带；B为Notch-2和b-actin的Western Blot代表性条带；C为pBcl-2、caspase-3和b-actin的条带灰度值比值汇总图；D为Notch-2和b-actin条带灰度值比值的汇总图

2.3异甘草酸镁注射液联合紫杉醇增加MCF-7细胞凋亡相关蛋白表达空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组及联合组分别干预MCF-7细胞后，凋亡相关蛋白pBcl-2在空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组和联合组差异有统计学意义(F=11.064，P<0.001)，联合组的pBcl-2蛋白表达均高于其他三组(1.94，0.79，0.83和1.01，均P<0.001)。Caspase-3蛋白表达在空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组和联合组差异无统计学意义(F=2.287，P=0.11)；Notch2蛋白表达在空白对照组、异甘草酸镁注射液组、紫杉醇组和联合组差异无统计学意义(F=2.849，P=0.063)。异甘草酸镁注射液与紫杉醇联合组的Caspase-3蛋白表达高于空白对照组、异甘草酸镁注射液组(3.17 比 2.01，P=0.027；3.17 比 2.13，P=0.046)，而与紫杉醇单药组相当(3.17 比 2.46，P=0.160)。联合组的Notch2蛋白表达与紫杉醇单药组差异无统计学意义(1.17 比 0.82，P=0.121)，高于空白对照组、异甘草酸镁注射液组(1.17 比 0.67，P=0.018；1.17 比 0.69，P=0.022)。详见图3。

3 讨论

化疗是乳腺癌综合治疗的基石，紫杉醇是继蒽环类药物之后为乳腺癌病人治疗的化疗药物，但体外研究表明药物外排蛋白高表达或者乳腺癌干细胞等均可导致紫杉醇耐药[2-3]。异甘草酸镁作为甘草酸的一种立体异构体，主要由天然甘草提取并碱化后制成镁盐形式，其生物学活性包括抗炎、肝保护、抗氧化和抗病毒等[4]。少部分临床前及临床研究表明异甘草酸镁有一定抗肿瘤活性[5-6]。Arase等[7]在慢性丙肝病人进行不同时长甘草酸预处理的长期观察，长时间服用(甘草酸2～16年)、短期服用(<2年)和未服用者，肝癌的发生率分别是7%、12%和25%，可见甘草酸具有抗肿瘤的作用，但需要长期服用。其分子机制探讨中主要活性成分甘草次酸修复强致癌剂苯丙芘诱导的DNA损伤，以及抑制鸟氨酸脱羧酶激活作用。此外，甘草酸在子宫内膜癌、胃癌KATOⅢ细胞和白血病原髓细胞表现出抑制增殖作用[8]。然而，目前对于甘草酸在抗癌领域的研究也只是处于一个起步的阶段，异甘草酸镁单药及联合紫杉醇诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡及作用机制等尚不清楚，仍需要进一步的研究来探讨。我们研究结果显示浓度在0.1～100 μmol/L之间的异甘草酸镁注射液对MCF-7细胞的增殖抑制作用随着药物浓度的升高而增强，之后略有下降，在100 μmol/L达到最高峰。100 μmol/L异甘草酸镁联合10 μmol/L紫杉醇联合组显著增加MCF-7细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率。

异甘草酸镁促进紫杉醇凋亡的机制探讨发现联合组的pBcl-2、Caspase-3蛋白表达均高于其他三组(P<0.05)；Bcl-2是抗凋亡蛋白，pBcl2为磷酸化Bcl2状态，丧失了对细胞凋亡的抑制作用，造成线粒体等细胞器的功能丧失和细胞器内促凋亡因子的释放，导致细胞凋亡。联合组和紫杉醇组的Notch2蛋白表达相较于均增加空白对照组和异甘草酸镁注射液单药组。Notch信号通路参与细胞增殖、分化及凋亡。研究表明，乳腺癌细胞与乳腺癌干细胞中存在Notch信号途径的异常活化[9-10]，并且这种异常活化与内分泌及曲妥珠单抗治疗耐受相关[11-12]。因此，靶定Notch信号途径可能是一种治疗转移性乳腺癌的新策略。γ-分泌酶抑制剂(γ secretase inhibitors)可以阻断Notch信号途径活化所必须的细胞内溶蛋白性裂解过程，从而抑制肿瘤细胞及肿瘤干细胞增殖[13-15]。前期研究发现，紫杉醇单药与Notch2活化相关，本研究进一步证实异甘草酸镁能增强紫杉醇的促凋亡作用，与Notch2活化仍有关。

总之，异甘草酸镁注射液协同促进紫杉醇诱导乳腺癌细胞(MCF-7细胞株)凋亡，其机制可能与促进紫杉醇通过Notch通路上调MCF-7细胞pBcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表达有关，本研究为临床上增效紫杉醇抗肿瘤作用提供了理论依据。