HPLC法测定黄藤素纳米柔性脂质体的含量及包封率

付丽娜，李伟泽,赵 宁，李维凤

(1.西安交通大学药学院，西安 710061；2.西安医学院药学院，西安 710021)

黄藤素(palmatine)又名掌叶防己碱、巴马汀、棕榈碱和非洲防己碱等，是从防己科植物黄藤(FibraurearecisaPierre)的干燥藤茎中提取精制而得[1]。黄藤素具有明显的抗炎抑菌作用，其抗真菌作用尤佳，还具有体外抗阴道毛滴虫的活性，安全无毒[2-3]。但由于黄藤素脂溶性较差，生物利用度较低[4]，限制了其临床应用。纳米柔性脂质体具有较高的包封率和稳定性[5-7]，粒径多为数十至数百纳米，外观为胶体溶液。本实验利用注入法制备黄藤素柔性纳米脂质体，建立黄藤素柔性纳米脂质体的含量及包封率测定方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；ZEN-3600Malvern激光粒度仪(马尔文公司)；Quintix224-1CN电子天平、SIGMA1-14离心机(赛多利斯科学仪器有限公司)；52-AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；B11-1型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；FJ-200高速分散匀质机(上海标本模型厂)；DDS-307电导率仪(上海仪电科学仪器有限公司)；JEM-2000EX透射电镜(日本电子株式会社)。

1.2试药 黄藤素对照品(中国食品药品检定研究院，质量分数≥98%)；黄藤素(西安小草植物科技有限责任公司，批号XC20140304，质量分数≥98%)；大豆卵磷脂(湖北远成药业有限公司)；胆固醇(上海山浦化工有限公司)；1,2-丙二醇(厦门星鲨制药有限公司)；硫酸鱼精蛋白(Sigma公司)；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1黄藤素纳米柔性脂质体的制备 称取卵磷脂3.5 g与胆固醇0.02 g，用无水乙醇10 mL溶解，于-0.05 MPa、50 ℃条件下浓缩，以无水乙醇复溶至10 mL，形成油相。将1，2-丙二醇20 mL加入蒸馏水76 mL中混匀，得水相。取1/3水相，加黄藤素0.2 g溶解，并于50 ℃以100 r·min-1磁力搅拌将油相缓慢注入，水合5 min，以20 000 r·min-1均质5 min，将剩余2/3水相加入，继续高速均质5 min，最后通过聚丙烯滤膜(0.22 μm)过滤2次，4 ℃保存备用[8-9]。

取少量上述脂质体混悬液，将稀释液样品适量滴于铜载网上，晾干后用质量浓度为15 mg·mL-1的磷钨酸进行负染色，于透射电子显微镜下观察其形态(加速电压2 kV，分辨率0.2 nm)，结果见图1。另取适量黄藤素纳米柔性脂质体用蒸馏水稀释，采用激光粒度仪测定其粒径及表面Zeta电位。结果见图2。

图1黄藤素纳米柔性脂质体透射电镜图

Fig.1 The TEM images of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

图2黄藤素纳米柔性脂质体粒径(A)和电位(B)分布图

Fig.2 The size (A) and zeta potential (B) distribution of palmatine-loaded flexible nano-liposomes

由图1可知，黄藤素纳米柔性脂质体外观为圆形或椭圆形，内部具有同心圆的指纹状结构，其原因可能是由于柔性脂质体加入丙二醇后，使脂质体双分子膜的柔性和变形性提高[10]。由图2可知，黄藤素纳米柔性脂质体的粒径集中在200 nm处，表面Zeta电位为-49.7 mV，当Zeta电位的绝对值>30 mV时，纳米粒表面存在大量净电荷，纳米粒间存在较大的静电排斥力，有利于提高纳米制剂的稳定性[11-12]。因此，黄藤素纳米柔性脂质体囊泡彼此之间的静电排斥力较大且具有较强的物理稳定性。

2.2黄藤素纳米柔性脂质体的含量与包封率测定

2.2.1试剂的配制 鱼精蛋白：称取硫酸鱼精蛋白 0.1 g，用蒸馏水溶解，定容于10 mL量瓶中，即得质量浓度为10 mg·mL-1的鱼精蛋白溶液。

消解液：吸取Triton X-100 12 mL，用甲醇稀释至100 mL，即得体积分数为12%的Triton X-100甲醇溶液。

2.2.2色谱条件 Hypersil BDS C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)色谱柱；流动相：乙腈(A)-0.4 mL·L-1磷酸(B)(20∶80)；检测波长：345 nm[13-14]；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL；柱温：25 ℃。

2.2.3专属性考察 对照品溶液的制备：精密称取黄藤素对照品20 mg，置于10 mL量瓶中，用双蒸水配制成质量浓度为2 mg·mL-1的储备液。精密量上述储备液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流动相稀释成质量浓度为20 μg·mL-1的溶液。

样品溶液的制备：精确量取黄藤素纳米柔性脂质体1.0 mL，加入体积分数为12% 的TritonX-100甲醇溶液2 mL，使脂质体膜材溶解，用流动相定容至10 mL，以13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤。

阴性溶液的制备：按照2.1项下方法不加入黄藤素制得空白脂质体溶液。吸取上述对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶中，按照2.2.1项下消解液的制备方法，制得阴性溶液。

取上述3种溶液各20 μL，进样，得HPLC图。在该色谱条件下，黄藤素能达到基线分离且峰形稳定，脂质体及辅料不干扰黄藤素的测定。

2.2.4线性关系考察 精密称取黄藤素对照品0.028 g，加蒸馏水配制成质量浓度为0.84，2.8，8.4，14.0和25.2 μg·mL-1的对照品溶液，精密移取各溶液20 μL，注入液相色谱仪中测定，以峰面积为纵坐标(y)、质量浓度为横坐标(x)，建立标准曲线：y=94.637x-43.44(r=0.999 8)，结果表明，黄藤素在质量浓度为0.84～25.2 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.5精密度测定 按照2.2.3项下方法配制高、中和低(25,13.95和0.8 μg·mL-1)3个质量浓度的黄藤素对照品溶液，按照色谱条件测定峰面积，每日(0，2，4，6，8和10 h)进样，测定峰面积，结果其日间和日内精密度RSD值均小于2%。

2.2.6回收率测定 精密量取9份阴性溶液各1 mL，置于10 mL量瓶中，编号为1～9。每3份中分别精确加入2 mL高、中和低(25.2,14和0.84 μg·mL-1)3个质量浓度的黄藤素对照品溶液，同时加入体积分数为12%的Triton X-100甲醇溶液，摇匀后定容，以13 000 r·min-1离心5 min，取上清液，按照2.2项下方法测得RSD值为0.75%，结果见表1。

表1黄藤素回收率测定结果

Tab.1 Results of recovery test of palmatine

编号加入量/μg·mL-1测得量/μg·mL-1回收率/%平均回收率/%RSD/%12524.65298.60899.040.7522524.73598.94032524.85699.424413.9513.93199.863 80513.9513.92699.827 96613.9513.92299.799 2870.80.78598.12580.80.78397.87590.80.79198.875

2.2.7黄藤素纳米柔性脂质体的含量测定 精密吸取黄藤素脂质体0.75 mL，置于5 mL量瓶中，加入体积分数为12%的Triton X-100甲醇溶液消解至澄清透明，摇匀，取20 μL进样测定，即为脂质体中黄藤素的含量。测定3个批次样品，结果黄藤素质量浓度分别为98.1，97.5和99.3 g·mL-1，RSD值为0.93%。

2.2.8黄藤素纳米柔性脂质体包封率的测定 精确量取黄藤素纳米柔性脂质体1.5 mL，置于5 mL离心管中，加入质量浓度为10 mg·mL-1的鱼精蛋白溶液1.5 mL，摇匀后静置3 min，在室温条件下以13 000 r·min-1离心10 min，见图3；弃上清液，脂质体沉淀物用体积分数为12%的Triton X-100甲醇溶液2 mL消解至澄清[15]，取20 μL进样测定，测定3批。包封率计算公式[16]：包封率=(W包封÷W总量)×100%，W包封为包封于脂质体的药物质量浓度，W总量为实际加入的总药量的质量浓度。结果3批包封率分别为80.67%，77.88%和78.41%，RSD值为1.88%。

图3鱼精蛋白凝聚法沉淀黄藤素纳米柔性脂质体效果图

Fig.3 The photo of precipitating palmatine-loaded flexible nano-liposomes with protamine aggregation method

蛋白质对脂质体稳定性的影响较为复杂，蛋白质可键合或吸附在脂质体表面，使脂质体密度增大；也可部分插入双分子脂质层或穿透整个脂质膜，从而影响其稳定性[17]，由图3可知，采用鱼精蛋白法能使脂质体与游离药液明显分离，且游离药液澄清透亮。

3 讨论

本文以丙二醇为柔软剂，采用注入法制备黄藤素纳米柔性脂质体，制备过程中发现：黄藤素纳米柔性脂质体对药物的包封率随着丙二醇用量的增加而增大；当丙二醇用量大于20 mL时，包封率开始逐渐降低，因此本次脂质体制备的处方选用丙二醇用量为20 mL。

为了准确测定黄藤素纳米柔性脂质体的包封率，须将脂质体和游离的药物有效分离。常用葡聚糖凝胶柱色谱法、透析法和超速离心法等分离脂质体。其中葡聚糖凝胶柱色谱较为常用，但葡聚糖表面上许多位点能与脂质体膜结合并相互作用，导致膜渗透性的改变和包裹物质的渗漏且脂质体易被稀释；透析法过程缓慢，适合分离小分子物质；超速离心法易破坏脂质体，且对于小粒径脂质体特别是纳米脂质体分离效果较差[18-19]。鱼精蛋白凝聚法主要是通过在脂质体表面吸附某种蛋白质来增加脂质体的密度使游离药物与脂质体通过离心后达到有效分离。本文用约含2/3以上精氨酸的鲑鱼精蛋白，是一种含有胍基的带正电的碱性氨基酸[20-21]。黄藤素纳米柔性脂质体带有负电荷。多聚阳离子鱼精蛋白会与带负电的脂质体产生絮凝作用，并通过离心将脂质体和游离药物分离。实验发现，不同体积的鱼精蛋白溶液加入黄藤素纳米柔性脂质体，凝聚效果也有差异，鱼精蛋白溶液加入过多，对脂质体有稀释作用，形成的脂质体凝集量较少；鱼精蛋白溶液加入过少，虽能有效分离脂质体，但由于游离药物溶液过少，不利于取样分析。因此经过多次实验，最终加入与样品量同体积的鱼精蛋白溶液，能有效分离脂质体和游离药物，且利于取样分析。

本实验所建立的黄藤素分析方法精密度较高，变异系数较小，HPLC法结合鱼精蛋白法可快捷、准确地测定黄藤素纳米柔性脂质体的含量和包封率，且专属性强，辅料不会对主药含量测定产生干扰，可用于黄藤素纳米柔性脂质体的质量控制。