let-7a荷载AS1411与lipidoid共修饰阳离子脂质复合物的制备

仲婷婷 李言 高彬彬

摘      要：构建了let-7a荷载AS1411与lipidoid共修饰阳离子脂质复合物，并对其理化性质进行考察。合成荷正电荷类脂质材料N，N-二油酰三羟甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺（Lipidoid），然后结合乙醇注入法与静电吸附法，制备荷载let-7a的AS1411与lipidoid共修饰阳离子脂质复合物（let-7a/AS1411-Lipoplex），评价其制剂学性质。通过薄层色谱法（TLC）、核磁共振法（1H-NMR）、傅里叶转变红外法（FT-IR）和液质联用仪（LC-MS）法验证了Lipidoid的结构。所制得let-7a/AS1411-Lipoplex大小规整，平均粒径为70 nm，Zeta电位为30 mV，AS1411-Lipoplex明显改善let-7a在血清中降解。成功构建可高效荷载let-7a的适配体（AS1411）与lipidoid共修饰的脂质复合物，为后续研究打下基础。

关  键  词：let-7a;适配体;类脂多胺;阳离子脂质复合物

中图分类号：TQ 350.35       文献标识码： A      文章编号： 1671-0460（2019）12-2817-04

Abstract：To prepare and evaluate let-7a-loaded aptamer and lipidoid co-modified cationic lipoplex （let-7a-As- lipoplex），a novel cationic lipid like material， N， N-dioleoyltris （2-aminoethyl） amine （Lipidoid） was obtained through the substitution and amidation reaction method. After verifying the structure of Lipidoid， let-7a-loaded AS1411 and lipidoid co-modified cationic lipoplexs（let-7a-As-lipoplex） were prepared through the ethanol injection and electrostatic adsorption technique. The physicochemical properties of lipoplexs， such as particle size， Zeta potential and encapsulation efficiency of let-7a were investigated. Finally， the in vitro stabilities of let-7a were measured. TLC， 1H-NMR，FT-IR and LC-MS assay were used to confirm the structure of Lipidoid. A novel cationic lipoplex modified with Lipidoid and AS1411 was developed which have spherical structure with mean size of 70 nm and Zeta- potential of 30 mV. In vitro anti-RNase test showed that co-modified cationic lipoplexs improved the stability of let-7a in serum. The preparation method of let-7a-loaded AS1411 and lipidoid co-modified cationic lipoplexs was established.

Key words： Let-7a; AS1411; Lipidoid; Cationic lipoplexs

let-7a作為早期发现的人类miRNA，引起大家广泛关注。研究表明，let-7a在肿瘤，尤其在肺癌呈下调的趋势，并与其进程负相关。let-7a与肺癌患者的预后也有密切关系，能够调节肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[1-5]。上调let-7a，有望达到效发挥肺癌的治疗[6]。但是， naked-miRNA极易被血清中的Nulease降解，与细胞膜发生静电排斥，导致细胞摄取率低，故临床应用中具有局限性。关于miRNA类的非病毒类载体的研究备受瞩目，成为有效进行基因治疗的关键手段[7， 8]。阳离子脂质复合物（或脂质体）具有较高的基因包封率、细胞摄取和可生物降解等特点，但是，其细胞毒性又成为屏障。所以，关于肿瘤靶向性荷正电脂质载体的研究日益受到研究者的兴趣[9]。

本研究首先合成新型阳离子脂质材料N，N-二油酰三羟甲基氨基甲烷（2-氨基乙基）胺（N，N-dioleoyltris （2-aminoethyl） amine，Lipidoid），然后进行肿瘤靶向性AS1411修饰[10]，探究其作为miRNA的载体的可行性，以便为后续研究提供依据。

1  实验部分

1.1  实验材料

三氟乙醇、三-（2-氨乙基）胺、（阿拉丁试剂有限公司）;Oleoyl chloride（日本和光纯药工业株式会社）;β-丙内酯（将来实业有限公司）;DMAEMA（萨恩化学技术有限公司）;胆固醇（国药集团化学试剂有限公司）;大豆磷脂S100（Lipoid）;羧基荧光素标记的let-7a（FAM-let-7a，正义链：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，反义链5-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3，上海吉玛有限公司）。

1.2  实验仪器

旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），中压玻璃层析柱（联华玻璃仪器厂），超导核磁共振谱仪（美国瓦里安公司），水平电泳槽（美国Bio-Rad公司），凝胶成像系统（英国syngene公司），激光粒度仪（美国PSS公司），透射电镜（美国FEI公司）。

2  实验方法

2.1  Lipidoid的合成

取三氟乙醇（7 mL）和油酰氯（6.2 mL），在圆底烧瓶中混合，再加入催化剂三乙胺（2.6 mL），在恒温条件下回流过夜（85 ℃）。反应结束，将上述烧瓶中的液体转移到分液漏斗萃取，萃取剂是水和乙酸乙酯。通过旋转蒸发去掉有机相中过量的乙酸乙酯和三氟乙醇，获得粗产物。以石油醚：乙酸乙酯（20∶1）为展开剂，薄层色谱分析。将上述展开剂滴加至浸泡于石油醚的硅胶柱，梯度洗脱分离并收集洗脱液。收集过程中，用薄层色谱法来确定产物，旋转蒸发得到类脂的中间体。

取乙醇（20 mL）和三-（2-氨乙基）胺（1.1 g），放在适宜圆底烧瓶中混匀，再加入中间体（4.0 g），烧瓶抽真空后充入氮气，在恒温搅拌（85 ℃，24 h）。以氯仿：甲醇（10∶1）为展开剂，硅胶薄层色谱分析。取样品溶液缓慢滴加到氯仿浸泡平衡的硅胶柱，梯度洗脱，收集洗脱液。合并含Lipidoid收集瓶，挥发洗脱液，即得[11]。通过薄层色谱法、核磁共振法和傅里叶转变红外法表征中间体和终产物的化学结构。

2.2  荷载let-7a的脂质复合物的制备与表征

2.2.1  AS1411修饰荷载let-7a的脂质复合物的制备（let-7a-As-lipoplex）

空白脂质复合物通过乙醇注入法制备。分别称取S-100大豆磷脂（15 mg），胆固醇（8 mg），Lipidoid（11 mg），超声溶解于无水乙醇（1 mL），缓慢滴入恒温蒸馏水（37 ℃，10 mL），挥发乙醇，得脂质复合物（lipoplexs）。按照已优化的N/P比（25：1），将let-7a与lipoplexs混勻，孵育（37 ℃，30 min），得荷载let-7a的脂质复合物（let-7a-lipoplex）。将适配体（FITC-AS1411）与let-7a-lipoplex共孵育（37 ℃，30 min），即得适配体修饰脂质复合物（let-7a-As-lipoplex）。

2.2.2  let-7a-As-lipoplex的评价

检测lipoplex的粒径及Zeta电位，透射电镜（TEM）观察其大小和形态。

2.2.3  抗RNase A降解实验

将let-7a-As-lipoplex与等量naked-let-7a溶液分别与等体积的RNAse A溶液（10 mg/mL）混合均匀，放置预定时间（0 min～5 h）后加EDTA溶液使酶失活停止降解，加入肝素溶液（0.7 mg/ml）置换出游离的let-7a，涡旋，孵育（20 min）。琼脂糖电泳法考查let-7a-As-lipoplex的稳定性。

2.2.4  血清稳定性实验

分别精密量取naked let-7a和Apt-NLs- let-7a 100 μL，与血清孵育一定时间，琼脂糖电泳法考察let-7a-As-lipoplex抗血清降解能力。

3  实验结果

3.1  中间体与Lipidoid的结构表征

3.1.1  薄层色谱法

中间体和Lipidoid的薄层色谱分离结果如图1所示。可见，中间体油酸三氟乙酯和Lipidoid的斑点，且周围未见清晰的杂质斑点。

3.1.2  核磁共振法

在油酸三氟乙酯氢谱图中，于4.5 ppm处可见酯键的吸收峰，验证产物的生成。在终产物Lipidoid图谱中，中间体酯键的位移峰消失（4.5 ppm），出现新的位移峰，与生成的产物中酰胺键上的H位移相同，根据与酰胺键中N相连的碳上H和油酸链中不饱和C上H的峰面积推算出产物是含2个油酸链的Lipidoid，推测产物的结构式与Lipidoid一致，证实Lipidoid的生成。

3.1.3  红外

自中间体的红外光谱图结果发现，因为C=O的伸缩振动在1 745和3 447 cm-1处有两个峰，因为C-O的伸缩振动在1 148和1 283 cm-1处出现了峰，验证了中间体的合成。终产物的红外结果图显示，酰胺键中C=O的伸缩振动峰出现在1 648 cm-1，N-H的弯曲振动在1 545 cm-1处，3 300 cm-1处也有N-H的伸缩振动峰，验证了Lipidoid的合成。

3.1.4  Lipidoid的MS图谱

MS图谱结果表明，化合物分子量是675.4，与Lipidoid的分子量一致，验证Lipidoid的合成。

3.2  let-7a-As-lipoplex的粒径、电位和形态表征

阳离子脂质体的的粒径和电位，测定结果见表1。

let-7a荷载脂质复合物（let-7a-lipoplex）的粒径与空白脂质复合物（lipoplex）比较，具有一定的增加趋势，Zeta电位变化不大。经适配体修饰后的let-7a-lipoplex的粒径呈明显的增加，其机制有待于进一步研究。

TEM结果图表明（图2-A），let-7a-lipoplex的微粒大小分布均匀，形态圆整[12]。空白脂质复合物的稳定性实验结果（图2-B），在30天内，其粒径变化不大。故后续实验中采用制备lipoplex保存，然后考察前实施let-7a的荷载与AS1411修饰的方法。

3.3  Lipoplex對let-7a保护能力的考察

结果表明（图3-A），0.6 mg/mL的肝素溶液能够将let-7a-As-lipoplex中的let-7a置换。图3-B显示，naked-let-7a在RNAse酶作用1 h后条带已消失，而let-7a-As-lipoplex中的let-7a在2 h到12 h间依然可以看见清晰的条带，与RNAse酶混合24 h后仍然有80%左右（图3-C）。证明本方法制备的let-7a-As-lipoplex能保护let-7a不受酶的作用。

3.4  血清稳定性实验

如图4所示，裸let-7a在血清中孵育1 h后条带就已消失，let-7a-As-lipoplex中的let-7a在24 h后仍然有清晰的条带，说明载体能递送let-7a，不受血清中核酸酶的降解。

4  结论

通过自制新型阳离子材料Lipidoid，乙醇注入法制得阳离子脂质复合物lipoplex，又在其表面连接了具有肿瘤靶向特点的适配体（AS1411）。所制备的Apt-NLs形状圆整、粒径大小均一，荷载let-7a后其粒径约为100 nm，荷正电荷。体外抗RNA酶降解实验和血清稳定性实验结果都表明let-7a-As-lipoplex能够很好的保护let-7a的稳定性，该项研究为let-7a相关的细胞学评价与体内肿瘤研究提供了实验依据。

参考文献：

[1]Tang， R.， et al. MiR-let-7a inhibits cell proliferation， migration， and invasion by down-regulating PKM2 in gastric cancer[J]. Oncotarget， 2016，7（5）： 5972-5984.

[2]Zhao， W.， et al. Induction of microRNAlet7a inhibits lung adenocarcinoma cell growth by regulating cyclin D1[J]. OncolRep， 2018，40（4）： 1843-1854.

[3]Zhou， B.， et al. Let-7a inhibits migration， invasion and tumor growth by targeting AKT2 in papillary thyroid carcinoma[J]. Oncotarget， 2017， 8 （41）： 69746-69755.

[4]Zhang， Y.， Q. Yang， and S. Wang. MicroRNAs： a new key in lung cancer[J]. Cancer ChemotherPharmacol， 2014， 74 （6）： 1105-1111.

[5]Takamizawa， J.， et al. Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J]. Cancer Res， 2004， 64（11）： 3753-3756.

[6]He， X.， et al. Let-7a elevates p21（WAF1） levels by targeting of NIRF and suppresses the growth of A549 lung cancer cells[J]. FEBS Lett， 2009， 583（21）： 3501-3507.

[7]Chen， Y.， D.Y. Gao， L. Huang. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy： challenges andstrategies[J]. Adv Drug Deliv Rev， 2015. 81（1）： 128-141.

[8]Lin， L.T.， et al. Involvement of let-7 microRNA for the therapeutic effects of Rhenium-188-embedded liposomal nanoparticles on orthotopic human head and neck cancer model[J]. Oncotarget， 2016. 7 （40）： 65782-65796.

[9]Lee， H.Y.， et al. Targeted delivery of let-7a microRNA encapsulated ephrin-A1 conjugated liposomal nanoparticles inhibit tumor growth in lung cancer[J]. Int J Nanomedicine， 2013. 8： 4481-4494.

[10]Perepelyuk， M.， et al. Aptamer-hybrid nanoparticle bioconjugate efficiently delivers miRNA-29b to non-small-cell lung cancer cells and inhibits growth by downregulating essential oncoproteins[J]. Int J Nanomedicine， 2016， 11（1）： p. 3533-3544.

[11]沈盼. EGFR受体介导肺肿瘤靶向siRNA脂多胺修饰脂质体的体内动态与药效学评价[D]. 苏州大学， 2015.

[12]张海， 张学全， 赵明颖， 等. 生物可降解聚（己内酯-β-苹果酸内酯）两亲性高分子的合成及作为药物载体研究[J]. 当代化工， 2018， 47 （4）： 661-665.