土木香内酯增效替莫唑胺抑制胶质瘤干细胞增殖的分子机制

王迅 任彤 郭天林

【摘要】 目的：研究土木香内酯（ALT）联合替莫唑胺（TMZ）对胶质瘤干细胞增殖的作用及其机制。方法：取人胶质瘤细胞U87MG、U251MG进行培养，ALT、TMZ单独或联合干预。使用MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，蛋白免疫印迹法（Western blot）检测凋亡通路蛋白Cleaved-caspase-9、Caspase-9、Bcl-2和Bcl-xl等表达量。结果：ALT和TMZ联合使用后胶质瘤干细胞生存率明显低于单独用药组差异有统计学意义（P<0.05）;ALT和TMZ联合使用后胶质瘤干细胞凋亡比例明显高于单独用药组，差异有统计学意义（P<0.05）;与单独使用TMZ相比，ALT与TMZ联合使用后，促凋亡蛋白Cleaved-caspase-9明显增强，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）结论：ALT可增加TMZ抑制胶质瘤干细胞增殖的效果，且其主要通过上调促凋亡蛋白，下调抑凋亡蛋白实现。

【关键词】 土木香内酯 替莫唑胺 胶质瘤 干细胞 增殖 凋亡

[Abstract] Objective： To study the effect and mechanism of Alantolactone combined with Temozolomide on the proliferation of glioma stem cells. Method： Human glioma cells were cultured with U87MG and U251MG， and were interacted with Alantolactone and Temozolomide alone or in combination. Cell proliferation was detected by MTT. Apoptosis was detected by flow cytometry. The expressions of Cleaved-caspase-9， Caspase-9， Bcl-2 and Bcl-xl were detected by Western blot. Result： The survival rate of glioma stem cells was significantly lower than that of the control group （P<0.05）. The apoptosis rate of glioma stem cells after the combination of Alantolactone and Temozolomide was significantly higher than that of the single drug group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Compared with used alone for Temozolomide， the combination of Alantolactone and Temozolomide promote the apoptosis protein cleaved Caspase-9 enhanced obviously， suppression of apoptosis protein significantly lower the Bcl-2 and the Bcl-xl， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： ALT can increase the inhibitory effect of TMZ on the proliferation of glioma stem cells， which is mainly achieved by up-regulating apoptotic protein and down-regulating apoptotic protein.

[Key words] Alantolactone Temozolomide Glioma Stem cell proliferation Apoptosis

First-authors address： Dalian Third Peoples Hospital， Dalian 116033， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.006

膠质瘤是中枢神经系统中发病率最高的原发性肿瘤，约占脑部肿瘤的42.6%[1]，其中恶性胶质瘤占全部胶质瘤的60%左右，是致命性非常强的肿瘤之一[2]。目前针对胶质瘤传统的治疗方式主要是手术切除病灶，并结合放化疗治疗[3]。然而，由于神经胶质瘤主要表现为浸润性生长，通过手术难以彻底将肿瘤组织和脑组织分开并切除[4]，胶质瘤干细胞对其具有一定耐药性，目前治疗效果不理想[5]。因此，需要寻求一种更优的治疗化疗方案。凋亡是细胞的一种程序性死亡，在细胞增殖生长状态中发挥重要作用[6]。正常生长的细胞受到精密调控，然而肿瘤细胞可无限增殖，研究证实肿瘤细胞的无限增殖主要是由于凋亡受到抑制[7]。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是目前临床上治疗神经胶质瘤的一线药物[8]，其可诱导胶质瘤细胞DNA损伤，抑制细胞增长，促进胶质瘤细胞死亡，其可促进胶质瘤细胞凋亡。土木香内酯（ALT）是植物土木香中的倍半萜化合物，具有祛痰、镇咳和抗菌等作用[9]。近年来研究发现ALT有抗肿瘤细胞增殖的作用。目前已有的报道发现，ALT可抗肺癌、结肠癌、肝癌、白血病等[10-14]。ALT分子量小，吸收快，对肝肾无毒性。然而目前关于ALT是否能影响TMZ对胶质瘤干细胞的作用研究尚少，因此本研究将侧重于探索ALT联合TMZ对胶质瘤干细胞增殖的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人胶质瘤细胞系U87MG和U251MG购自ATCC细胞库，由本实验室培养传代冻存。

1.2 实验药品及制备 TMZ购自美国ATCC公司，用DMSO 解稀释成50 mM，冻存在-20 ℃备用。ALT购于上海永叶科技有限公司。DMEM高糖培养基、特级胎牛血清购自艾莱萨生物科技有限公司，Annexin V-PE/7-AAD 凋亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;cleaved-caspase-9、caspase-9、Bcl-2和Bcl-xl购于Cell Signaling Technology。

1.3 主要仪器及设备 二氧化碳培养箱，NUAIRE，美国;电泳槽、电泳仪，BIO-RAD，美国;流式细胞仪，BD，美国。

1.4 细胞培养 U87MG、U251MG细胞培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中;在37 ℃，CO2浓度为5%的培养箱中培养。

1.5 MTT法检测细胞生存率 取对数生长期的U87MG、U251MG细胞，吸出细胞培养基，用PBS清洗后向培养皿中加入500 μL胰酶消化液，充分摇晃混匀，1 min后加入含有血清的细胞培养基终止胰酶的消化，用移液器轻轻吹打细胞，制成8×104个/mL密度的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，100 μL/孔，在二氧化碳培养箱中培养过夜，待细胞贴壁后，弃掉正常培养基，分别加入含有ALT（20 μm）、TMZ（25 μm）、ALT（20 μm）+TMZ（25 μm）的药物培养基，另外设定DMSO（二甲基亚砜）对照组，共4组，每组实验设立6复孔，于37 ℃培养箱中培养48 h后，每孔加入10 μL MTT液混匀，培养3 h后，吸出原培养基，每孔各加100 μL DMSO，充分震荡混匀10 min，用酶标仪检测双波长490 nm处吸光度（OD值），计算细胞生存率。

1.6 流式细胞仪凋亡检测 胶质瘤细胞成球后，向细胞中分别加入ALT（20 μm）、TMZ（25 μm）、ALT（20 μm）+TMZ（25 μm），在37 ℃培养箱中培养48 h后，收集细胞。在1 000 r转速下离心5 min，弃上清。细胞经PBS清洗1次后用StemPro Accutase消化液消化细胞5 min，并轻轻吹打混匀，再1 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清。取未做任何处理的细胞分装3管作为对照组，每个样品加300 μL的Binding Buffer 轻轻吹打混匀，各加4 μL Annexin V和4 μL PI 染色，对照组两个单染对照，一个空白对照，室温避光孵育30 min，用过滤网过滤后，用流式细胞仪检测胶质瘤干细胞的凋亡比率。

1.7 Western Blot检测 胶质瘤细胞成球后，加入ALT（20 μm）、TMZ（25 μm）、ALT（20 μm）+TMZ（25 μm）处理48 h，轻轻吹打细胞球，移入离心管中，置于低速离心机中1 000 r/min，离心5 min，结束后弃上清获得胶质瘤干细胞沉淀。加入100 μL细胞裂解液裂解30 min，随后在12 000×g  4 ℃的条件下离心15 min，取上清即为胶质瘤干细胞蛋白。测定并调整蛋白浓度，加入loading buffer，100 ℃煮5 min，制样完毕，保存在-80 ℃冰箱备用。将蛋白样本进行电泳、转膜、封闭后，加入对应的Cleaved-caspase-9、Caspase-9、Bcl-2和Bcl-xl等一抗孵育過夜，用TBST洗膜15 min，然后与对应的二抗孵育1 h，洗膜30 min。2 h内用ECL化学发光，用凝胶成像仪成像。

1.8 统计学处理 使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料用（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT和TMZ单独或联合使用对胶质瘤干细胞生存率的影响 单独使用ALT、TMZ及其两者联合对U87MG及U251MG来源的胶质瘤干细胞进行干预48 h后，用MTT检测胶质瘤干细胞生存率。研究结果显示，无论是U87还是U251，与对照组相比，使用25 μm TMZ后细胞生存率无明显下降，差异无统计学意义（P>0.05）;然而与20 μm ATL联用后细胞生存率明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1、图1。

2.2 ALT和TMZ单独或联合使用对胶质瘤干细胞凋亡的影响 ALT、TMZ单独及其二者联合对U87MG及U251MG来源的胶质瘤干细胞处理后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。研究结果显示，无论是对U87还是U251，ALT和TMZ联合使用后细胞凋亡比例均高于单独使用TMZ，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2、图2。

2.3 ATL和TMZ单独或联合使用对胶质瘤干细胞凋亡蛋白表达的影响 ALT、TMZ单独及其二者联合对U87MG及U251MG来源的胶质瘤干细胞进行干预后，使用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白。结果显示，与单独使用TMZ相比，ALT与TMZ联合使用后，促凋亡蛋白Cleaved-caspase-9明显增强，抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3、4及图3。

3 讨论

胶质瘤是脑部肿瘤中发病率和致死率较高的恶性肿瘤[15]，其传统治疗方式主要是手术切除结合术后放化疗治疗[16]。然而，神经胶质瘤在外科手术中很难完全切除，且通常对放射治疗不敏感并容易损害正常的神经系统[17]。TMZ作为治疗胶质瘤的临床一线化疗药，其价格昂贵、副作用大（骨髓抑制明显）、且耐药率显著升高[18]。已有研究证实ALT能从多途径发挥抗胶质母细胞瘤的作用，且获取方便，价格低廉，毒副作用小，并能通过血脑屏障[19]。若能进一步证实ALT与TMZ对胶质瘤干细胞具有协同增效作用并确定其作用机制，不仅能促进ALT的临床转化，而且达到了降低TMZ用量的目的，从而在减少患者痛苦的同时，减轻了家庭和社会的经济负担，使更多的胶质瘤患者获益，应用前景广阔。本次研究发现，ALT可以提高胶质瘤干细胞对TMZ的敏感性，ALT联合TMZ能降低胶质瘤干细胞的生存率，证明ALT与TMZ对胶质瘤干细胞具有协同增效作用。

腫瘤的发生发展是一受多因素调控的复杂过程，细胞凋亡在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，研究证实，胶质瘤干细胞的过度增长是由于细胞凋亡受到抑制[20]。细胞凋亡主要受到促凋亡基因和抗凋亡基因两大类基因的调控。两种凋亡相关基因失衡时，即当细胞促凋亡基因活性受抑制和/或抗凋亡基因被激活，细胞无法正常发生凋亡，生命周期延长，最终可能导致细胞癌变和肿瘤形成。目前研究较为清除的与肿瘤发生发展密切相关的凋亡相关基因主要有 Bcl-2基因家族，其中Bcl-2和Bcl-xl为两个重要抗凋亡基因[21]。ALT能有效提高胶质瘤细胞凋亡水平[22]，然而ALT联合TMZ是否也能通过凋亡途径实现对胶质瘤干细胞的控制目前尚未知。本研究结果显示，ALT可增强TMZ促进胶质瘤干细胞凋亡的作用。并能通过促进粒体凋亡通路下游的促凋亡蛋白Caspase-9的裂解活化，下调抑凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达，从而增强TMZ诱导胶质瘤干细胞凋亡的能力。

综上所述，ALT可增加TMZ抑制胶质瘤干细胞增殖的效果，且其主要通过上调促凋亡蛋白，下调抑凋亡蛋白实现，这可能为以后胶质瘤的化学治疗提供新的联合治疗方案。

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（收稿日期：2019-08-21） （本文編辑：周亚杰）