熊胆粉对运动性疲劳大鼠的抗疲劳作用研究

黄春艳 周微 刘金丽 佟雷 王妍 邵丽丽 史嘉翊

【摘要】 目的：分析熊膽粉用于运动性疲劳大鼠抗疲劳作用及其作用机理，旨在为开发缓解疲劳和提高运动能力的系列天然产品提供可靠的实验室依据。方法：将50只wistar大鼠根据随机数字表法分为五组，每组各10只，分别为空白对照组（未给药未运动）、疲劳模型组（未给药的运动大鼠）、高剂量给药组[2.8 g/（kg·d）熊胆粉]、中剂量给药组[1.4 g/（kg·d）熊胆粉]、低剂量给药组[0.7 g/（kg·d）熊胆粉]。空白对照组和疲劳模型组大鼠每日给予相应剂量的蒸馏水。末次灌胃给予熊胆粉溶液后，将各组大鼠分别置于段氏实验跑台，观察其初始时刻状态，记录并对比各组大鼠跑台运动时间;取血，检测并对比各组大鼠血清血乳酸（BLA）、尿素氮（BUN）表达及乳酸脱氢酶（LDH）活力;取血后将大鼠处死，取大鼠肝脏，精密称取100 mg，另取各实验组大鼠后肢大腿内侧肌肉组织100 mg，检测并对比其肝糖原（LG）、肌糖原（MG）含量。结果：五组运动大鼠中，高剂量给药组运动时间>中剂量给药组>低剂量给药组>疲劳模型组，组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。五组大鼠中，空白对照组血清BLA、BUN表达、LDH活力最低，后依次为高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组，疲劳模型组最高。血清BLA、BUN表达五组组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;中剂量给药组与高剂量给药组LDH活力比较，差异无统计学意义（P>0.05），其他组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。五组大鼠中，高剂量给药组大鼠LG、MG表达均最高，后依次为中剂量给药组、低剂量给药组，疲劳模型组表达均最低;各组MG含量组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）;中剂量给药组与低剂量给药组LG含量比较差异无统计学意义（P>0.05）;其他组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：熊胆粉能够提高运动性疲劳大鼠LDH活力，增加其LG与MG含量，使大鼠BLA含量降低，运动耐力大大增强，药物抗运动性疲劳效果理想。

【关键词】 运动性疲劳 熊胆粉 抗疲劳作用

[Abstract] Objective： To analyze the anti-fatigue effect of bear bile powder in rats with exercise-induced fatigue and its mechanism of action， and to provide reliable laboratory basis for the development of a range of natural products that relieve fatigue and improve athletic performance. Method： A total of 50 wistar rats were divided into 5 groups according to random number table， with 10 rats in each group， they were blank control group （without administration and exercise）， fatigue model group （exercised rats were without administration）， high-dose administration group （exercised rats were given 2.8 g/kg Bear Bile Powder）， middle-dose administration group （exercised rats were given 1.4 g/kg Bear Bile Powder）， low-dose administration group （exercised rats were given 0.7 g/kg Bear Bile Powder）. The rats in blank control group and fatigue model group were given same dose of distilled water each day. After the last gavage with Bear Bile Powder solution， each group of rats was placed on the Duans experimental treadmill， the initial time state was observed， and the treadmill running time of each group of rats were recorded and compared. The blood of rats were taken， the blood lactic acid （BLA）， blood urea nitrogen （BUN） expression and lactate dehydrogenase （LDH） activity in each group were detected and compared. After taking the blood， the rats were sacrificed and the liver of the rats were taken. 100 mg inner thigh muscle tissue of the hind limbs of rats were taken， and the contents of liver glycogen （LG） and muscle glycogen （MG） were detected and compared. Result： Among five groups of exercised rats， the exercise time of high-dose administration group was longer than that of middle-dose administration group， low-dose administration group and fatigue model group， and the difference was statistically significant between two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the serum BLA， BUN expression and LDH activity in blank control group were the lowest， followed by high-dose administration group， middle-dose administration group， and low-dose administration group， and fatigue model group was the highest. The statistical analysis found that there was statistical difference in the expression of serum BLA and BUN among five groups （P<0.05）. There was no statistical difference in the LDH activity between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Among five groups of rats， the expression of LG and MG were the highest in the high-dose administration group， followed by the middle-dose administration group and low-dose administration group， and the expression of fatigue model group was the lowest. The statistical analysis found that there was significant difference in the content of MG between two groups （P<0.05）; There was no statistical difference in the content of LG between middle-dose administration group and high-dose administration group （P>0.05）， but there was statistical difference between other two groups （P<0.05）. Conclusion： Bear Bile Powder for rats with exercise-induced fatigue can increase LDH activity， increase LG and MG contents， decrease BLA in rats， enhance exercise tolerance， and achieve ideal anti-fatigue effect.

[Key words] Exercise-induced fatigue Bear Bile Powder Anti-fatigue effect

First-authors address： Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.31.007

运动性疲劳是指运动导致的肌肉最大输出功率或最大收缩暂时性下降的一种生理现象，肌肉运动能力下降是其主要标志与本质特性[1]。随着现代竞技体育发展，人们运动强度越来越大，尤其是青壮年人群，运动性疲劳发生率越来越受人们重视，现已成为运动医学领域研究热点[2]。正常情况下，运动性疲劳只是一种生理现象，是机体的自我保护，属于超量恢复的一个良性过程。适度的运动性疲劳若施以合理干预，能够帮助机体机能水平恢复与提高，反之若未及时恢复或治疗，不断累积的疲劳会引起过度疲劳导致力竭，生理性的运动性疲劳会转变为病理性运动性疲劳，严重伤害运动机体[3-4]。可见，给予运动性疲劳患者早期合理治疗干预的重要性。

目前，运动性疲劳治疗主要方法包括心理疗法、药物疗法、物理疗法等手段，主要是为了缓解患者运动疲劳，提高其机体运动能力，但治疗效果均无法达到预期[5]。随着人们对中医药的重视，加之其治疗的特性，越来越多的研究证实，中药干预运动性疲劳效果理想，且具有安全性[6]。运动性疲劳在祖国传统医学中类似于“劳损”“劳倦”“虚劳”，药物治疗方面有活血行气药、补虚药等[7]。熊胆粉是人工引流熊胆干燥品，现已被国家卫生部批准作为新药使用，其性寒、味苦，入脾、肝、胆、大肠、胃经，具有平肝明目之功。现代药理学研究证实，熊胆粉化学成分复杂，经其制作而成的熊胆粉制剂有一定抗疲劳之效，加之该药能保肝利胆，故可考虑将其运用至运动性疲劳的治疗中[8-9]。但目前并无研究证实其用于运动性疲劳的价值。本研究通过分析熊胆粉的抗疲劳作用及其作用机理，旨在为开发缓解疲劳和提高运动能力的系列天然产品提供可靠的实验室依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 于2017年10月12日购入50只雄性Wister大鼠，大鼠日龄3～7 d，平均（5.0±2.0）d;体重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。随机将50只大鼠分为五组，每组各10只，分别为空白对照组、疲劳模型组、高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组。各组大鼠常规分笼饲养，自由进食饮水，自然光照。空白对照组大鼠日龄3～5 d，平均（4.0±1.0）d;体重230～250 g，平均（240.0±10.0）g。疲劳模型组大鼠日龄4～6 d，平均（5.0±1.0）d;体重240～260 g，平均（250.0±10.0）g。高剂量给药组大鼠日龄3～7 d，平均（5.0±2.0）d;体重230～260 g，平均（245.0±15.0）g。中剂量给药组日龄3～6 d，平均（5.5±1.5）d;体重230～270 g，平均（250.0±20.0）g。低劑量给药组大鼠日龄3～5 d，平均（4.0±1.0）d;体重240～260 g，平均（250.0±10.0）d。各组大鼠一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 空白对照组未运动。建立疲劳模型大鼠，建模方法：在22～25 ℃的室温下，将40只需要制备模型的大鼠放置在直径为150 cm，高为60 cm，水深为40 cm，水温为25～30 ℃的Morris水迷宫水槽中进行游泳训练，在大鼠下腹部挂10 g铅团负重游泳，每次将同组的大鼠一起放入，以大鼠口鼻被水淹没7 s中为宜，后捞起。捞起后续迅速将大鼠吹干。训练时间：1次/d，6次/周，间隔1 d休息，共训练5周。给药方法：空白对照组未给药，疲劳模型组为运动大鼠但未给药，高剂量给药组给予熊胆粉2.8 g/（kg·d），中剂量给药组给予熊胆粉1.4 g/（kg·d），低剂量给药组给予熊胆粉0.7 g/（kg·d），其中空白对照组与疲劳模型组每日给予对应剂量的蒸馏水。大鼠跑台运动时间测定：末次灌胃给予熊胆粉溶液后，将疲劳模型组、高剂量给药组、中剂量给药组及低剂量给药组大鼠分别置于段氏实验跑台，观察大鼠初始时刻状态，此时大鼠应激性表现强烈，经过在跑台的运动后，大鼠体现出疲劳状态，此时大鼠应激性反应与逃避反应能力均显著下降，出现此状态后分别记录各组大鼠跑台运动时间。全部大鼠给药干预观察时间均为5周。

1.3 观察指标与检测方法 （1）运动时间：检测记录并对比五组大鼠运动时间，即开始运动至力竭时间。（2）大鼠血清中血乳酸（Blood lactic acid，BLA）、尿素氮（Urea nitrogen，BUN）表达及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）活力测定：使用0.25 mL/100 g 3%戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉跑步运动后疲劳大鼠，将其固定于解剖台上，将其腹腔剪开并扒开内脏，经其腹主动脉采血4 mL，各组大鼠血液样本经2 000 r/min离心后，使用吸管收集上清液，使用Olympus Au400型全自动生化分析仪检测大鼠BLA、BUN含量;使用深圳晶美生物工程有限公司提供的乳酸脱氢酶试剂盒，经分光光度法检测其表达。（3）大鼠肝糖原（Liver Glycogen，LG）、肌糖原（Muscle glycogen，MG）贮备量检测：每只大鼠在完成取血后，将其处死，立即取肝脏与骨骼肌组织各100 mg，使用0.95%冰生理盐水洗净，使用滤纸将水分吸干，向内投入10%中性福尔马林溶液固定1～2 d，切片后制作组织切片。使用深圳深圳晶美生物工程有限公司提供的试剂盒检测大鼠肝脏LG与肌肉MG。

1.4 统计学处理 应用SPSS 20.0统计学软件处理数据，以（x±s）表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五组运动大鼠运动时间比较 疲劳模型组、高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组运动大鼠运动时间分别为（5.26±0.48）、（9.03±0.56）、（8.69±0.71）、（8.12±0.65）min，高剂量给药组运动时间>中剂量给药组>低剂量给药组>疲劳模型组，组间两两比较差异均有统计学意义（F=62.229，P<0.001）。

2.2 五组大鼠血清中BLA、BUN表达及LDH活力比较 五组大鼠中，空白对照组血清BLA、BUN表达、LDH活力最低，后依次为高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组，疲劳模型组最高。血清BLA、BUN表达五组间两两比较，差异均有统计学意义（P<0.05）;中剂量给药组与高剂量给药组LDH活力比较，差异无统计学意义（P>0.05），其他组间两两比较差异均有統计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 五组大鼠LG、MG含量比较 五组大鼠中，高剂量给药组大鼠LG、MG表达均最高，后依次为中剂量给药组、低剂量给药组，疲劳模型组表达均最低。各组MG含量组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）;中剂量给药组与低剂量给药组LG含量比较差异无统计学意义（P>0.05），其他组间两两比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

运动性疲劳是一种常见生理反应，可直接影响机体运动水平正常发挥，影响运动性疲劳的因素多样，其中代谢性产物的堆积带来的影响最为剧烈，如蛋白质代谢产物尿素氮与糖酵解代谢产物乳酸等[4]。

短时间剧烈运动后，受到心肺功能的限制，短时间内无法满足糖完全氧化需要的氧供，肌肉细胞将处于缺氧状态，此时主要依靠机体内糖的无氧酵解途径提供给运动需要的能量，乳酸是糖酵解后主要产物，此时大量的乳酸会堆积于骨骼中，并释放进入血液中，大大增加机体内血乳酸含量[10-11]。机体在正常的状态下，其乳酸的合成分泌及清除是一个动态平衡的状态，当机体内乳酸的合成分泌量超出清除量时，大量累积的乳酸将对内环境的稳定产生影响，降低机体运动能力，最终诱发运动疲劳[12]。应晓明等[13]在2009年的研究中发现，疲劳大鼠血乳酸表达显著高于健康对照组，该研究认为乳酸的累积是产生运动性疲劳的一大外周机制。还有研究认为，运动组大鼠血浆乳酸含量较安静组大鼠高，减少乳酸堆积后可改善疲劳状态[14]。本研究结果显示，较空白对照组，疲劳模型组大鼠BLA含量更高，该结果与上述研究结果一致，提示乳酸堆积可能是诱发运动性疲劳的主要机制，在干预时可由此机制着手。在正常的生理条件下，蛋白质基本不参与提供能量，若长时间剧烈运动，将破坏体内能量系统，此时氨基酸与蛋白质分解代谢增强，氨将在肝脏内转变为尿素氮，并向血液内渗透增加血液内尿素氮含量，最终诱发运动性疲劳[15]。本研究结果显示，较空白对照组，疲劳模型组大鼠血清BUN水平更高，可见降低机体尿素氮水平是提高机体抗运动性疲劳的关键所在。肝脏是机体重要器官，在运动期间起到关键作用，肝脏耗氧量在大脑之后，对缺氧敏感度极高。肝脏在机体处于有氧代谢时，肝糖原每摩尔会合成并分泌38 mol ATP，但若在无氧代谢情况下，合成并分泌的ATP仅有3 mol，剧烈运动会大量消耗掉肝糖原，导致机体缺氧，此时肝脏的有氧代谢出现异常，其所需来源主要依赖于肝细胞无氧酵解，ATP生成降低对机体运动能力产生影响，故诱发疲劳[16]。

既往开展的物理、药物治疗等干预手段用于运动性疲劳虽有一定效果，但应用价值未能达到预期，现有研究认为可采取中医药干预。运动性疲劳在中医学中无概念，根据其临床表现，现代医家将其归属于“劳倦”等范畴，认为其发生发展主要因气血亏损导致对应脏腑生理功能失调或功能障碍引起，可为其选择保肝抗疲劳之药[17]。熊胆是熊科动物棕熊或黑熊的干燥胆囊，熊胆粉作为熊科动物黑熊经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，其性寒、味苦，入肝、胆、脾、大肠、胃经，具有平肝、清热、名目之功，现代药理学证实，熊胆粉化学成分复杂，主要有鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、胆酸、去氧胆酸、胆色素、胆固醇等，其中熊去氧胆酸是其重要成分[18]。瞿凤国[19]发现，复方熊胆粉制剂能通过延长爬杆时间与游泳时间来提高运动耐力，提高肝糖原含量，降低BLA与BUN含量，从而提高乳酸脱氢酶活力，为机体提供更多能力，增强抗疲劳能力，延缓运动性疲劳产生，进一步提高机体对运动负荷适应能力。基于此结论，本研究对比分析了不同组别大鼠未使用/使用不同剂量熊胆粉后运动各血清学指标水平结果显示，疲劳模型组运动时间最短，高剂量给药组最长，且疲劳模型组血清BLA、BUN表达最高，LG、MG表达最低，而其他各组运动大鼠在接受不同剂量熊胆粉治疗后，血清BLA、BUN表达降低，LG、MG表达升高，该结果与上述研究结果基本一致，提示熊胆粉可通过降低血清BLA、BUN表达，提高LG、MG表达，增强大鼠运动耐力与抗运动性疲劳能力。

综上所述，熊胆粉能够提高运动性疲劳大鼠LDH活力，增加其LG与MG含量，使大鼠BLA含量降低，运动耐力增强，药物抗运动性疲劳效果理想，为下一步探讨熊胆粉对运动性疲劳的效果与机制提供了良好的运动性疲劳动物模型。

参考文献

[1] He L，Ren J，Shi Z，et al.Separation of Key Biogenic Amines by Capillary Electrophoresis and Determination of Possible Indicators of Sport Fatigue in Athletes Urine[J].J Chromatogr Sci，2016，54（8）：1428-1434.

[2] Bosia F，Merlino M，Pugno N M.Fatigue of self-healing hierarchical soft nanomaterials： The case study of the tendon in sportsmen[J].Journal of Materials Research，30（1）：2-9.

[3]代朋乙，黄昌林.运动性疲劳研究进展[J].解放军医学杂志，2016，41（11）：955-964.

[4]翟艺宗，黄昌林，常祺，等.中频脉冲电流经皮刺激肝区对运动性疲劳大鼠肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响[J].解放军医学杂志，2015，40（4）：327-330.

[5] Hilfiker R，Meichtry A，Eicher M，et al.Exercise and other non-pharmaceutical interventions for cancer-related fatigue in patients during or after cancer treatment：a systematic review incorporating an indirect-comparisons meta-analysis[J].Br J Sports Med，2018，52（10）：651-658.

[6]王明明，张红娟.运动性疲劳的中医生理整体观[J].中国运动医学杂志，2015，34（12）：1211-1214.

[7]周庆莹，刘宏岩.中药缓解运动性疲劳的研究进展[J].长春中医药大学学报，2018，34（2）：406-408.

[8]陶敏，赵文静，旺建伟.熊胆粉的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息，2013，30（3）：153-155.

[9]周超凡，高国建，刘颖.熊胆粉研究进展述评[J].中国中药杂志，2015，40（7）：1252-1258.

[10] Patikas D A，Williams C A，Ratel S.Exercise-induced fatigue in young people： advances and future perspectives[J].Eur J Appl Physiol，2018，118（5）：899-910.

[11] Lima F D，Stamm D N，Della Pace I D，et al.Ibuprofen intake increases exercise time to exhaustion：A possible role for preventing exercise-induced fatigue[J].Scand J Med Sci Sports，2016，26（10）：1160-1170.

[12]李博雅，房栋栋，闾坚强.乳酸与骨骼肌运动性疲劳关系的研究进展[J].医学综述，2016，22（4）：640-643.

[13]应晓明，邵晓梅，方剑乔.不同针灸疗法抗大鼠运动性疲劳疗效比较[J].中华中医药学刊，2009，27（1）：125-127.

[14]陶恒沂，张红星，陶凯忠，等.高压氧对长跑运动员急性疲劳恢复过程的影响[J].中国运动医学杂志，2003，22（1）：14-17.

[15]吕昊.含硒蛋白运动补剂缓解运动性疲勞作用研究[J].食品研究与开发，2016，37（21）：172-175.

[16]石鹤坤，陈开杰，林小凤，等.公石松水提液对小鼠运动能力与血清乳酸、尿素氮及肝糖原的影响[J].药学实践杂志，2016，34（5）：399-402.

[17]段金成，罗顺迪，曹祖高，等.西归粗多糖对游泳力竭小鼠的抗运动性疲劳作用[J].中成药，2018，40（3）：681-684.

[18]李梦，朱婷婷，寇冠军，等.熊胆粉制剂临床应用的研究进展[J].天津中医药，2015，32（10）：637-640.

[19]瞿凤国.复方熊胆粉制剂抗疲劳作用的实验研究[D].吉林：吉林大学，2006.

（收稿日期：2019-04-29） （本文编辑：周亚杰）