“关-开”型近红外荧光探针用于铁离子和黑茶抗氧化活性测定

王贞睿 齐风佩* 罗 苗 曹一鸣 刘洪涛苏建科 张常青 龙立平 刘长辉*,2

1(湖南城市学院材料与化学工程学院, 黑茶金花湖南省重点实验室，益阳 413000)2(湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，长沙 410082)

1 引 言

铁是生命体中不可或缺的微量元素之一，也是血红蛋白、血红素、多种酶和免疫系统的重要组成部分。铁元素在质子转移、细胞新陈代谢、酶催化反应及氧的运输与储存等生理过程中发挥着重要的作用[1,2]。然而，人体内铁元素的缺乏会导致生理系统紊乱，而摄入过量的铁也会诱发心脏病、贫血症、糖尿病及肾衰竭等多种疾病，甚至死亡[3～5]。工农业生产中广泛使用的铁会造成环境污染，因此Fe3+的检测对环境监控及人类健康具有非常重要的意义。目前，文献报道的Fe3+检测方法主要有比色法[6,7]、伏安法[8]和原子吸收光谱法[9]等。与上述检测方法相比，荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、信号可调、廉价、操作简便等优势[10,11]。由于Fe3+的顺磁性，铁离子荧光探针大都属于荧光淬灭型，易受其它淬灭过程的干扰，造成假“阳性”结果[12]。此外，大部分“关-开”型铁离子荧光探针的发射光处在短波长区域，容易受到环境的影响[13～19]，而近红外荧光探针具有背景干扰低、信噪比高等优势，可提高检测的准确度[15,16,20,21]。因此，发展高灵敏、高选择性的荧光增强型近红外荧光探针检测Fe3+具有非常重要的意义。

茶叶中的黄酮、儿茶素等抗氧化性物质能有效抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化活性[20]，其测定方法主要有清除自由基能力法[21]、氧化自由基吸收能力法[22]及铁离子还原法[23]。其中，铁离子还原法是基于Fe3+被还原为Fe2+后与三吡啶三嗪(TPTZ)络合引起吸光度的变化来检测抗氧化活性[23]。然而，分光光度法的灵敏度偏低。因此，开发高灵敏的分析方法检测茶叶的抗氧化活性具有非常重要的意义。

图1 CyQ-Cys探针的构建及其对铁离子的响应机理Fig.1 Chemical construction of CyQ-Cys probe and fluorescent response towards Fe3+

据文献报道，金属离子可与生物硫醇如谷胱甘肽(GSH)及半胱氨酸(Cys)分子中的羧基、氨基和巯基配位[17,24]，从而改变检测体系的光学信号，实现对金属离子的检测。本研究通过简单方法合成喹啉类花菁染料(CyQ)，利用卤素-巯基的亲核取代及重排反应共价结合Cys[25,26]，进一步合成了近红外荧光探针(CyQ-Cys)，可高选择性、快速识别Fe3+(见图1)。同时，基于Fe3+介导的“关-开”策略，构建了一种黑茶抗氧化活性检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

F-4500荧光分光光度计、UV-3100 紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司)； Varian INOVA400核磁共振仪(美国Varian公司)；HP1100LC/MSD质谱仪(美国Agilent公司)。

4-甲基喹啉、碘乙烷、金属离子的高氯酸盐均购自美国Sigma-Aldrich公司； 其余化学试剂均为国产分析纯；实验用水为二次蒸馏水。

2.2 实验方法

2.2.1化合物CyQ的制备参考文献[27]方法，将0.432 g(2.5 mmol) 4-甲基-N-乙基喹啉、0.338 g(1.0 mmol)N-[(3-(苯胺基亚甲基)-2-氯-1-环己烯-1-基)亚甲基]苯胺盐酸盐及0.205 g(2.5 mmol)无水醋酸钠溶于15 mL乙醇中，在氮气保护下于80℃反应1 h。冷却后，旋蒸除溶剂，然后在氯仿/醋酸钠溶液中搅拌1 h，过滤，真空干燥，柱层析分离(展开剂为甲醇/二氯甲烷，V/V，1:19)，得棕红色固体0.286 g，产率47.2%。1H NMR (400 MHz, DMSO-D6)δ: 1.38( t, 3H), 1.52(t, 3H), 1.68(m, 2H), 2.76 (m, 4H), 4.58(q, 2H), 4.85(q, 2H), 5.45(d, 1H), 6.15(s, 1H), 6.52(d, 1H), 6.63(s, 1H), 6.72～7.30(m, 5H), 8.12～8.62(m, 6H), 9.85(d, 1H)。13C NMR (100 MHz, DMSO-D6)δ: 165.3, 146.8, 145.3, 144.0, 140.8, 139.3, 137.7, 136.2, 133.0, 130.4, 128.4, 126.1, 125.5, 124.8, 123.8, 118.6, 118.0, 116.1, 108.2, 58.6, 49.3, 30.3, 27.6, 25.1, 16.5, 14.3。 MS,m/z: 480.23[M]+, 理论计算值, 479.22。合成路线见图2。

图2 CyQ的合成路线Fig.2 Synthesis route of CyQ

2.2.2探针CyQ-Cys的制备化合物CyQ用DMF配成10 μmol/L溶液，Cys用水配成200 mmol/L溶液。将400 μL 10 μmol/L CyQ溶液、适量Cys溶液和5.0 μL PBS缓冲液(10 mmol/L，pH 7)混合均匀，用DMF稀释至 500 μL。孵育3 min后，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，激发光和发射光的狭缝宽度均为10 nm，电压为 500 V，激发波长为460 nm，平行测试3次。

2.2.3选择性实验金属盐用去离子水配成1.0 mmol/L溶液，备用。在荧光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同金属离子溶液，孵育3 min后，用荧光分光光度计记录荧光信号变化，激发光和发射光的狭缝宽度均为10 nm，电压为 500 V，激发波长为460 nm，平行测试3次。

2.2.4Fe3+的检测在荧光池中加入500 μL上述CyQ-Cys溶液，测其荧光发射光谱，然后加入不同浓度的Fe3+溶液，用荧光分光光度计记录荧光信号的变化，激发光和发射光的狭缝宽度均为10 nm，电压为 500 V，激发波长为460 nm，平行测试3次。

2.2.5实际样品的检测准确称取10 g未处理的(毛茶)和发酵后的安化黑茶(金花黑茶)，于100 mL沸水中浸泡10 min。残渣再加沸水浸泡2次，合并滤液，浓缩至50 mL，用去离子水定容至100 mL，备用。在荧光池中加入400 μL CyQ-Cys溶液和100 μL 黑茶备用液，测其荧光发射光谱，激发光和发射光的狭缝宽度均为10 nm，电压为 500 V，激发波长为460 nm，平行测试3次。

3 结果与讨论

3.1 探针CyQ-Cys的构建及光谱表征

根据生物硫醇可与金属离子络合的特性，利用巯基与卤素之间的亲核取代反应和重排机制[25,26]，将化合物CyQ与Cys结合而构建探针CyQ-Cys。如图3A所示，随着Cys浓度的增加，化合物CyQ的荧光强度逐渐减弱，当Cys浓度为110 μmol/L时，荧光猝灭最明显，因此后续实验均采用此浓度。此外，研究了探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后的紫外-可见吸收光谱及荧光发射光谱的变化情况。如图3B所示，探针CyQ-Cys在460 nm处产生强的吸收峰，与Fe3+作用后，吸收峰的强度明显减弱。图3C表明，探针CyQ-Cys与Fe3+作用后，在近红外区662 nm处的荧光信号显著增强。光谱信号的变化说明，探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后展现了荧光的“关-开”过程，有利于Fe3+的荧光检测。

图3 (A) 化合物CyQ与Cys作用前后的荧光发射光谱; (B) 探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后的紫外-可见吸收光谱和(C)荧光发射光谱Fig.3 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ before and after addition of Cys; (B) UV-vis absorption spectra and (C) fluorescent emission spectra of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+

3.2 pH值的影响

考虑到Cys的等电点为5.05，CyQ-Cys作为Fe3+的荧光探针主要基于Fe3+与羧基、氨基和巯基之间的配位作用，而溶液的pH值会改变氨基的存在方式，进而改变CyQ与Cys的结合方式，从而影响CyQ-Cys的荧光响应。探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后在662 nm 处的荧光强度与pH值关系曲线见图4。如图4A所示，在pH=7时，探针CyQ-Cys的荧光信号较弱，但Fe3+的加入显著提高了体系的荧光强度。在pH 6.0～6.5范围内，Cys并不能有效淬灭化合物CyQ的荧光强度，尽管加入Fe3+后的荧光信号增强，但荧光强度的变化可以忽略不计；而pH=8.0时，探针Cys促使CyQ的荧光强度显著减弱，但加入Fe3+并不能恢复体系的荧光信号。可能是在酸性条件下，Cys分子中的氨基带正电荷，难以竞争取代巯基，导致荧光信号不易淬灭，而Fe3+会在碱性条件下形成Fe(OH)3，从而减少了其与探针CyQ-Cys的配位，阻碍了体系荧光信号的恢复。由图4B可知，探针CyQ-Cys的荧光信号在30 min内保持稳定，且与Fe3+作用后的荧光信号也保持恒定，说明探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后均具有较强的稳定性。因此，本方法可在pH=7的条件下检测Fe3+含量。

图4 (A) pH值对探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后的荧光强度(λem=662 nm)的影响; (B) 探针CyQ-Cys与Fe3+作用前后的稳定性Fig.4 (A) Effect of pH value on fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+;(B) Stability of CyQ-Cys before and after treatment with Fe3+ (λem=662 nm)

3.3 动力学过程

室温下，固定pH=7，在探针CyQ-Cys的荧光信号趋于平稳后加入Fe3+，进一步考察了探针CyQ-Cys与Fe3+反应过程中荧光发射光谱的变化。如图5所示，在30～60 s内，探针CyQ-Cys在662 nm处的荧光强度迅速增强，大约20 s后荧光强度达到最大并基本保持稳定，说明探针CyQ-Cys与Fe3+存在良好的络合作用且反应迅速，可用于对Fe3+的快速检测。

图5 探针CyQ-Cys与Fe3+作用的动力学曲线Fig.5 Kinetic curve of CyQ-Cys upon incubation with Fe3+ (λem=662 nm)

3.4 离子选择性

为了验证探针CyQ-Cys对Fe3+的选择性，选择Fe3+及其它常见离子为识别对象，考察它们与CyQ-Cys作用前后荧光强度的变化。图6A表明，Al3+、 Fe2+对CyQ-Cys荧光强度的增强可以忽略不计，Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+等离子使体系的荧光强度进一步减弱，而Fe3+可显著提高检测体系的荧光强度，表明探针CyQ-Cys用于Fe3+检测具有较好的特异性响应。尤其是Fe3+与其它金属离子共存时，如图6B所示，探针CyQ-Cys对Fe3+仍显示较强的抗干扰能力，说明探针CyQ-Cys是选择性良好的荧光增强型Fe3+近红外荧光探针。

图6 (A) 探针CyQ-Cys与不同离子作用前后的荧光发射光谱，(B) 在干扰离子共存下，探针CyQ-Cys与Fe3+作用后的荧光强度变化。F0和F分别表示探针加入金属离子前后在662 nm处的荧光强度，其中，1～10分别代表Cu2+、 Zn2+、 Hg2+、 Pb2+、 Mn2+、 Ag+、 Co2+、 Al3+、 Fe2+和Fe3+Fig.6 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys upon incubation with different ions; (B) Changes of fluorescent intensity of CyQ-Cys before and after addition of Fe3+. Inset, the number of 1 to 10 on behalf of Cu2+, Zn2+, Hg2+, Pb2+, Mn2+, Ag+, Co2+, Al3+, Fe2+ and Fe3+ respectively. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different metal ions, respectively (λem=662 nm)

3.5 Fe3+的检测

为了考察不同浓度Fe3+存在时体系荧光强度的变化，在此检测体系中加入不同浓度的Fe3+，测定相应的荧光发射光谱如图7所示。探针CyQ-Cys在662 nm处具有较弱的荧光信号，但随着Fe3+浓度的增加，其荧光强度逐渐增强，且Fe3+在40 ～300 μmol/L的浓度范围内与探针CyQ-Cys的荧光强度变化呈良好的线性关系，线性方程为y= 1.0619x+ 0.01355 (R2=0.9910)，检出限为10.4 μmol/L (S/N=3)。

图7 (A) 探针CyQ-Cys与不同浓度的Fe3+离子作用前后的荧光发射光谱；(B) 探针CyQ-Cys的荧光强度变化与Fe3+浓度的线性关系，F0和F分别表示探针CyQ-Cys加入Fe3+前后在662 nm处的荧光强度Fig.7 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ-Cys in the presence of different concentrations of Fe3+; (B) Plot of F/F0 versus Fe3+ concentration. F0 and F are fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.6 识别机理研究

图8 (A) 化合物CyQ与谷胱甘肽、半胱氨酸及N-乙酰基半胱氨酸反应的荧光发射光谱； (B) 探针CyQ-Cys与Fe3+的Job曲线Fig.8 (A) Fluorescent emission spectra of CyQ upon incubation of Cys, N-acetylcysteine (NAC), and glutathione (GSH); (B) Plot of F/F0 versus concentration ratio of Fe3+ to CyQ-Cys. F0 and F are the fluorescent intensity of CyQ-Cys in the absence and presence of different Fe3+, respectively (λem=662 nm)

3.7 实际样品中Fe3+检测

以益阳资江河水为测试对象，进一步评价本方法检测Fe3+的实用性，结果如表1所示，本方法检测环境水样中Fe3+的加标回收率和标准偏差符合检测要求，具有良好的应用前景。尤其是Fe2+极易被氧化为Fe3+，因此，本方法可应用于实际水样中铁含量的检测。

表1 资江河水中Fe3+的加标实验结果

Table 1 Determination of Fe3+in Zijiang river water samples

序号No.加入值Added(μmol/L)测得值Found(μmol/L)回收率Recovery(%, n=3)相对标准偏差RSD(%, n=3)10.00.0—250.050.8101.61.33100.098.598. 62.04150.0151.2100.81.7

3.8 黑茶抗氧化活性检测

参考铁离子还原法[23]，以茶叶水提物为测试对象，进一步考察本方法检测黑茶抗氧化活性的可行性，结果如表2所示。结果表明，检测体系的荧光强度随水提物体积分数的增大而下降，荧光强度越弱，表明更多的Fe3+被还原为Fe2+，即体系的还原性越强。因此黑茶具有较强的抗氧化活性，且金花黑茶的抗氧化活性高于毛茶。

表2 毛茶和金花黑茶的抗氧化活性

Table 2 Antioxidant capacity of raw tea and dark tea

序号No.水提物体积分数Volume fraction ofaqueous extract(%)毛茶Raw tea(F/F0)黑茶 Dark tea(F/F0)相对标准偏差RSD(%, n=3)110.00.910.842.2230.00.850.722.8350.00.780.661.7

4 结 论

合成了喹啉基花菁类染料CyQ，利用其与Cys的卤素-巯基亲核取代反应导致CyQ的荧光信号淬灭，构建了一种近红外荧光探针CyQ-Cys。根据Fe3+诱导CyQ-Cys体系的荧光强度明显恢复，建立了一种Cys介导的“关-开”型近红外荧光探针检测Fe3+的方法。本方法具有合成简单、响应速率快(< 30 s)、选择性高及近红外发射等优势，探针响应不受其它金属离子的干扰，并应用于Fe3+快速检测以及黑茶的抗氧化活性检测。