响应面法优化黑果腺肋花楸多糖提取工艺

◎ 宿华林，王 柳，牟 贺，孙玉叶，魏 登

（吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101）

黑果腺肋花楸，也称不老莓或野樱莓，是蔷薇科腺肋花楸属植物，原产于北美等地，目前在我国东北地区有大量种植。黑果腺肋花楸果实中的黄酮（鲜果含量高达到0.25%～0.35%）、花青素、多酚是已知植物中含量最高的，多糖的含量也较高。基于此，本文研究黑果腺肋花楸多糖的提取工艺，为黑果腺肋花楸的综合利用开发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

黑果腺肋花楸果实（鲜），购于吉林省安图县种植基地。试剂：无水乙醇、乙醚、浓硫酸、葡萄糖、1,1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、乙醇、浓盐酸、氢氧化钠以及D-半乳糖等，均购于吉林市物华玻化试剂有限公司。

分光光度计、精密天平、棕色容量瓶、1 mL移液管、吸耳球、小量杯、电子天平、微波消解仪、紫外-可见分光光度计、自动平衡离心机、旋转蒸发器以及真空干燥机等。

1.2 试验方法

采用微波辅助法提取黑果腺肋花楸多糖，对料液比、微波功率和提取时间3种因素进行对比分析，确定多糖提取条件，并对黑果腺肋花楸多糖提取工艺进行响应面法优化。称取黑果（鲜果）100 g，制浆，用蒸馏水溶解浆液，采用微波消解仪辅助法提取；在5 000 r·min-1离心10 min后过滤，再加入蒸馏水二次提取；合并2次提取的上清液，以1∶6的比例用旋转蒸发器浓缩，至提取液体积最小。加入80%乙醇，静置（8 h），再次5 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀。用石油醚和无水乙醇进行脱脂，真空干燥，制得黑果粗多糖[4]。

1.2.1 单因素试验设计

对料液比、微波功率和提取时间3个单因素进行试验，确定提取工艺的最适条件。

1.2.2 响应面优化

以料液比、微波功率和提取时间为自变量，提取量作为响应值，分析三因素与响应值之间的关系，采用响应面软件中的Box-Behnken方法设计3因素3水平的响应面试验。

1.2.3 多糖含量的测定

采用苯酚—硫酸比色法，测定黑果多糖含量，其计算公式[5]如式（1）。

人员、经费、就业政策和就业场地等基础性设施是保障独立学院就业市场稳定开展的前提条件。然而据调查，安徽省大多数独立学院专职从事就业工作的人员仅2～3人，人员配备的匮乏制约了对就业市场错综复杂事宜的精雕细琢，限制了就业供需市场的维护和开拓；另外，虽然教育部对高校就业经费的支出设定了指标，但是独立学业受办学的特点的局限，没有能力完成这一指标，致使促进就业相关活动的资金存在不足；同时就业政策是就业市场规范化的标杆，多数独立学院未建立与就业市场相关的制度，再由于教学用地的紧张，独立学院甚至没有安排传统的招聘教室，现代化的视频面试教室更是无从谈起，以上都严重的影响了就业市场的现代化进程。

1.2.4 多糖含量的测定

用20 mL蒸馏水溶解10 g黑果腺肋花楸粗多糖，调节pH值为8.5，加入双氧水使多糖溶液体积分数为40%，用恒温水浴锅在40 ℃下加热4 h，分别用流水和蒸馏水透析8 h，蒸馏水每小时更换1次，得脱色多糖。脱色后的多糖溶液中加入1 g胃蛋白酶，在37 ℃下酶解 4 h后，沸水加热 10 min，3 000 r·min-1离心10 min，去除变性蛋白质，留上层清液用水,在60 ℃条件下透析2 d，透析后的溶液中加入Sevag试剂（三氯甲烷与正丁醇体积比为4∶1），混合后振荡20 min，离心5 min，所得上层液为黑果腺肋花楸多糖溶液，重复以上步骤3次。旋转蒸发去除溶液中的三氯甲烷和正丁醇，加入2倍体积的95%的乙醇溶液进行醇沉，即得脱蛋白后的多糖样品。用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比为1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于层析袋中，用层析夹封好，在30 ℃条件下，于500 mL蒸馏水中静置透析7 h，每2 h更换1次缓冲液，离心，过滤去除沉淀，将剩余清液低温真空干燥后，得精制多糖。

2 结果与分析

2.1 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法，绘制葡萄糖标准曲线，其回归方程为Y=7.756x+0.086 35，R2=98.93%

2.2 单因素试验结果分析

如图1所示，料液比从1∶7提高到1∶9时，黑果多糖提取量快速上升，随着料液比的继续提高，黑果多糖提取量呈缓慢下降趋势。考虑效价比和成本选择料液比最佳比例为1∶9。如图2所示，随着微波功率提高，在500 W时，提取量最高，继而呈现下降趋势，故宜选微波功率500 W。如图3所示，提取时间呈先升高后下降趋势，25 min后延长提取时间出现下降趋势，因此应选择提取时间25 min，此时黑果多糖的提取率最高。

图1 料液比对黑果多糖提取量的影响图

图2 微波功率对黑果多糖提取量的影响图

图3 提取时间对黑果多糖提取量的影响图

2.3 响应面法优化

2.3.1 响应面试验设计及回归方程的确立

以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取时间）为自变量，Y（提取量）为响应值，进行响应面回归拟合分析，见表1～2。

表1 实验因素和水平表

表2 响应面试验设计及结果表

从表2响应面试验结果可知，影响黑果多糖提取的3个因素A、B和C与多糖提取量响应值Y之间的回归方程为Y=+4.31+0.14A+0.22B+0.052C+0.065AB-0.030AC+0.17BC-0.52A2-0.78B2-0.30C2。

由表3可知，A、B、C三个因素与提取量（Y）之间的相关关系高度显著，其中A、B、C、A2、B2和C2表现为高度显著（P＜0.01），AB、AC、BC较显著（P＜0.05），说明各自变量与因变量之间的关系不是简单的线性关系，可以预测相应的数值，证明该试验方案合理；失拟项P值为0.859 4＞0.05，为不显著，表明误差较小，拟合度高；从F值来看B＞A＞C，说明提取功率对黑果多糖提取量的影响最大，料液比次之，提取时间影响最小；R2＝0.996 3，R2Adj＝ 0.991 5，R2接近于1，该回归模型的拟合度效果好。

2.3.3 响应面结果分析

该模型显示微波功率对黑果多糖提取量的影响最大，料液比次之，提取时间最小，AB、BC之间具有明显的交互作用，且P值均小于0.05，AC交互作用不明显，P值大于0.05。

2.3.4 验证实验

试验结果表明，微波辅助法提取黑果多糖的最佳工艺为：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、微波提取时间25.16 min，提取量为4.46%，综合考虑实验操作的可行性以及生产的实际成本，将结果修正为：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波时间25 min，并进行三次以上实验验证，实际测得黑果腺肋花楸多糖含量为（4.46±0.02）%，与预测值基本相符。

2.4 多糖纯化

按照1.2.3黑果多糖含量的测定方法，得脱蛋白后的多糖样品，用所得黑果腺肋花楸多糖配置料液比为1∶100的多糖溶液，取10 mL多糖溶液至于层析袋中，用层析夹封好，在30 ℃条件下，于500 mL蒸馏水中静置透析7 h，每2 h更换1次缓冲液，离心，过滤去除沉淀，将剩余清液低温真空干燥后，得精制多糖7.32 g

3 结论

采用微波辅助法提取黑果多糖，以A（料液比）、B（微波功率）和C（提取时间）为单因素，用响应面法对黑果腺肋花楸多糖提取工艺进行优化，结果表明微波辅助法提取黑果花楸多糖的最佳工艺条件为：料液比1∶9.651（g·mL-1）、微波功率509.04 W、提取时间25.16 min，提取量预测为4.45%。综合考虑实验操作的可行性以及生产的实际成本，将结果修正为：料液比1∶10（g·mL-1）、微波功率500 W、微波时间25 min，并进行3次以上实验验证，实际测得黑果腺肋花楸多糖含量为（4.46±0.02）%。