二氧化钛纳米棒的制备及抗菌性能研究

(齐齐哈尔医学院 药学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

前言

近年来，世界各地严重的水体污染为致病菌的滋生和大量繁殖提供了天然的温床[1]。泛滥的细菌严重威胁了人类的生命。因此，抑制致病菌的生长繁殖和传播，最终杀灭致病菌和病毒已经成为当前一个亟待解决的难题。现有的杀灭细菌的方法主要是通过喷洒药物的方式，优点是灭菌效果明显且见效快。但缺点是这种方法很容易对环境产生二次污染，且长期喷洒药物会使细菌产生耐药性，从而导致细菌更难被杀灭[2]。因此，如何有效地杀灭细菌成为急需解决的一道难题。

当前，半导体材料为我们提供了一条有效的灭菌途径[3-4]。当用光照射半导体时，电子(e-)会被激发到半导体的导带上，从而在价带上产生空穴(h+)，激发的电子和产生的空穴分别具有还原性和氧化性，它们能与氧气及水分子反应，生成活性氧物质(ROS)，从而起到杀灭细菌的作用。这种灭菌方式简单、方便且不会污染环境。在众多的半导体材料中，纳米TiO2半导体材料，由于具有成本低、稳定性好和抗菌活性高等优势而备受研究者的关注[5]。

通过一种简单的水热法得到了TiO2半导体纳米棒材料[6]，所制备样品为锐钛矿晶相，这有利于发挥其光催化活性。在紫外光的照射下，样品对革兰氏阴性菌(绿脓杆菌)具有良好的杀灭效果。

图1 TiO2纳米棒的XRD图(a)和SEM图(b)Figure 1 The XRD pattern (a) and SEM image (b) of the TiO2 nanorods.

1 实验部分

1.1 材料及仪器

Ti(SO4)2、乙二胺、无水乙醇、柠檬酸均为分析纯试剂。LB培养基和 MH培养基，磷酸盐(PBS)缓冲液，绿脓杆菌标准株。

S-4800型日立扫描电子显微镜(日立仪器有限公司)，XRD-6000型X射线粉末衍射仪(日本岛津公司)，立式压力蒸气灭菌器(上海博迅实业有限公司)，1700紫外分光光度计(日本岛津公司)，GL-150恒温培养器(上海银泽仪器设备有限公司)，DHG-9040A型电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司)。

1.2 二氧化钛纳米棒的制备

0.24 g Ti(SO4)2和0.63 g柠檬酸溶解到14 mL去离子水中。在搅拌下，依次加入8 mL乙二胺和10 mL乙醇。搅拌30 min后转移到50 mL反应釜中，在180 ℃反应8 h。所得沉淀用无水乙醇和去离子水洗涤几次。将所得产物在60 ℃干燥箱中干燥12 h，最终得到TiO2纳米棒样品。

1.3 抗菌性能测试

采用微量稀释法测定样品的最低抑菌浓度(MIC)。

1)将冷冻保存的绿脓杆菌标准株涂于LB培养基上，37 ℃培养24 h。挑取单克隆菌落接种于MH液体培养基，37 ℃振荡过夜培养。用MH培养基稀释过夜菌液至5×105cfu/mL，按90 μL/孔加入到96孔板中；

2)称取一定量的TiO2粉末于磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成预定浓度悬浮液，然后在高压锅内用120 ℃的饱和蒸汽灭菌 20 min。然后在无菌操作台上用365 nm紫外光下照射悬浮液2 h，按10 μL/孔加入到菌液中，得到0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5 mg/mL的TiO2纳米棒浓度混合液；然后在37 ℃、180 r/min条件下培养24 h；根据光密度测试数值计算最低抑菌浓度。

1. 4 样品表征

使用XRD-6000型X射线粉末衍射仪(XRD)测试样品在2θ为10°～70°之间的衍射峰；用Hitachi S-4800型扫描电子显微镜(SEM)观察样品的形貌特征；用1700紫外分光光度计在波长为600 nm处测定绿脓杆菌的浓度。

2 结果与讨论

2. 1 晶相及形貌分析

众所周知，TiO2样品的晶相及形貌影响其性能。而晶相及形貌又决定于反应的温度和时间。多次实验结果证明，调节水热反应的温度为180 ℃，反应时间为6 h，能够制备得到合适晶相与完整形貌的TiO2纳米棒。如果反应温度过低，得到的样品非锐钛矿晶相，不利于样品的抗菌性能。而反应时间过短，不能得到完整的纳米棒形貌，也会影响样品的抗菌性能。图1a所示为最佳反应条件下得到的TiO2纳米棒的XRD图。纳米棒样品的衍射峰与标准锐钛矿相TiO2(PDF#73-1746)的衍射峰一致，说明所得样品为锐钛矿相。由于锐钛矿相相比金红石和板钛矿相TiO2的光催化效果更好，因此有利于样品发挥光催化抑菌作用。图1b为所得样品的SEM图，可以看出，所得样品为均一的纳米棒，且样品无团聚，分散性良好，长度450 nm左右。

2.2 样品抑菌性能分析

选择绿脓杆菌为目标菌种，在紫外光照射不同浓度TiO2纳米棒溶液2 h后，测试样品对绿脓杆菌的抑菌性能。所得数据见图2。从图2可以明显地看出，以对照样细菌的存活率100%为参比，随着TiO2纳米棒浓度的增大，绿脓杆菌的存活率逐渐下降，说明经过紫外光照射的TiO2纳米棒样品确实具有良好杀灭细菌的作用。尤其是当TiO2纳米棒样品的浓度达到0.2 mg/mL时，绿脓杆菌的存活率为28.8%，说明在很小剂量TiO2纳米棒样品存在的条件下，就具有很好的灭菌效果。而当样品的浓度增大到0.5 mg/mL时，绿脓杆菌的存活率仅为4.8%，细菌基本上已经被杀灭。

图2 绿脓杆菌在不同浓度TiO2纳米棒(0～0.5 mg/mL)条件下的存活能力Figure 2 The bacterial viability of P. Aeruginosa exposed to different concentrations (0～0.5 mg/mL) of TiO2 nanorods.

2.3 样品抑菌性能机理

为了更好地了解样品的抗菌性能，图3详细地描述了TiO2纳米棒的光催化灭菌机理。在365 nm紫外光照射下，光生电子从TiO2纳米棒的价带激发到其导带，这些电子会被TiO2纳米棒表面吸附的O2捕获形成超氧自由基(·O2-)和羟基自由基(·OH)。与此同时，留在TiO2纳米棒的价带光生空穴会和溶液中的H2O和 OH-反应生成羟基自由基(·OH)。这些活性氧物质(ROS)会攻击细菌并最终破坏细菌的细胞壁，并且能够分解组成细胞的物质，从而使细菌死亡，起到杀灭细菌的作用。

TiO2+ hv→h++ e-

H2O + h+→H++·OH

OH-+ h+→·OH

O2+ e-→·O2-→·OOH → H2O2→·OH

图3 TiO2纳米棒的光催化灭菌机理图Figure 3 Mechanism of photocatalytic bacterial killing of TiO2 nanorods.

3 结论

通过一种简单的水热法制备了形貌均一、单分散的TiO2纳米棒样品。所得样品不需经过煅烧处理就为锐钛矿相。在365 nm紫外光照射后，纳米棒样品对绿脓杆菌具有良好的杀灭效果，且随着所用样品浓度的增大，灭菌效果也逐渐增加。当样品的浓度为0.5 mg/mL时，TiO2纳米棒对绿脓杆菌的抑菌率达到95.2%，这为制备具有良好抗菌性能的纳米材料提供了一条可行的途径。