高效液相色谱串联质谱法快速检测大白菜中氰霜唑及其代谢物和氟啶胺的残留

张爱娟，梁 林，马新刚，刘 伟

(山东省农药科学研究院/山东省化学农药重点实验室，山东 济南 250033)

氰霜唑(cyazofamid)是新一代苯基咪唑类杀菌剂，对卵菌纲病原菌如疫霉菌、腐霉菌等具有很高的活性。已在我国大白菜、番茄、黄瓜、马铃薯、葡萄、西瓜等多种作物上取得登记。氰霜唑与植物病原菌细胞线粒体内膜结合，阻碍膜内电子传递，干扰能量供应，从而起到杀灭病原菌的作用。氰霜唑使用后会迅速分解成4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-腈(CCIM)、4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-甲酰胺(CCIM-AM)、4-氯-5-(4-甲苯基)-1H-咪唑-2-羧酸(CCTA)等多个代谢产物[1]。CCIM是氰霜唑在植物体内的主要降解产物，与氰霜唑相比具有更高的毒性[2]。

氟啶胺(fluazinam)是日本石原产业自主研发生产的2，6-二硝基苯胺类低毒、广谱性杀菌剂[3]。已在我国大白菜、番茄、黄瓜、辣椒、马铃薯等多种作物上取得登记。对食植性螨类和十字花科植物根肿病具有良好的防效[4～5]。但其环境毒性令人担忧，有研究表明，氟啶胺可引发哮喘病和皮炎等破坏人免疫系统的疾病[6]。

目前，国内外对氰霜唑的残留分析主要采用LC-MS/MS法，LC-DAD法和电化学法，这些方法大多仅建立了氰霜唑母体的分析方法而不包括代谢物CCIM[7～10]。朱光艳等[11]对氰霜唑及其代谢物在葡萄和土壤中的残留规律进行了研究；张翠芳等[12]对氰霜唑及其代谢物在黄瓜和土壤中的残留分析方法进行了研究，但未见氰霜唑及其代谢物在大白菜中残留分析方法的研究。

国外有文献报道，用气相色谱配氮磷和质谱检测器检测葡萄和葡萄酒中的氟啶胺[13～15]。国内有关氟啶胺的残留分析主要有气相色谱法检测辣椒和马铃薯中氟啶胺的残留[16～17]。超高效液相色谱串联质谱法检测马铃薯中氟啶胺的残留[18～19]；李冠华等[20]采用高效液相色谱法测定了大白菜和土壤中氟啶胺的残留，但样品前处理繁琐，有机溶剂用量大。

本文采用高效液相色谱串联质谱仪结合QuEChERS方法，建立了大白菜中氰霜唑及其代谢物(CCIM)和氟啶胺的残留量分析方法，该方法前处理简便、定性定量准确、分析方法快速、结果重现性好，可为开展氰霜唑和氟啶胺在大白菜上的风险评估及其安全使用研究提供检测依据。

1 材料与方法

1.1 材料 高效液相色谱质谱联用仪(Aglient 1290Ⅱ-6460)，Aglient公司；涡旋仪(QL-861)，江苏海门其林贝尔仪器制造公司；电子天平(JA21002)，上海精密科学仪器有限公司；离心机(TDL-5-A)，上海安亭科学仪器厂。

氯化钠、无水硫酸镁、甲酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技公司；分析纯，科密欧化学试剂有限公司)；C18吸附剂、N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)和石墨化碳黑(GCB)(天津艾杰尔公司)；氰霜唑标准品(纯度为99.5%，购自Dr.Ehrenstorfer GmbH)，CCIM标准品(纯度为95%，由中国科学院动物研究所提供)，氟啶胺标准品(纯度为99.0%，购自Dr. Ehrenstorfer GmbH)。

溶液配制：准确称取0.050 4g氰霜唑标准品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得1 003mg/L标准溶液；准确称取0.052 6 gCCIM标准品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得1 000mg/L标准溶液；准确称取0.038 8g氟啶胺标准品至50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容得772mg/L标准溶液。置于-20℃冰箱中保存，使用时再用乙腈稀释成氰霜唑(10mg/L)、CCIM(10mg/L)和氟啶胺(20mg/L)的标准混合溶液，于4℃冰箱中保存备用。

1.2 大白菜前处理方法 准确称取捣碎的大白菜样品10.0g于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈，涡旋1min，加入4g氯化钠，剧烈振荡1min，4 000r/min离心5min。取1mL上层清液转移至加有50mg C18填料和50mg无水硫酸镁的2mL离心管中，涡旋1min，静置后，上清液过0.22μm有机滤膜，待测。

1.3 色谱条件 色谱柱：Eclispe plus C18.RRHD色谱柱(50mm×2.1mm，1.8μm)；流动相：乙腈+0.1%甲酸水溶液体积比70：30；流速：0.3mL/min；进样体积：2μL；柱温：室温。

质谱，干燥气(氮气)流速：11L/min；雾化气压力：15 Psi；检测方式：多反应监测；干燥器温度：300℃；毛细管电压：4kv；碰撞气：氮气。在分析过程中，以保留时间和离子对(母离子和2个子离子)信息比较进行定性分析，以母离子和响应最高的子离子进行定量分析(表1)。

表1 氰霜唑、CCIM和氟啶胺质谱条件

2 结果与分析

2.1 仪器条件的确定 分别用10mg/L的氰霜唑、CCIM标准溶液，在电喷雾电离ESI(+/-)方式下进行全扫描(m/z50～500)，以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明在正离子采集模式下氰霜唑[M+1]峰(m/z324.9)为最强峰，CCIM[M+1]峰(m/z217.9)为最强峰。选择母离子进行子离子扫描，通过进一步优化碰撞能量，碎裂电压等参数，分别获得氰霜唑定量离子对m/z324.9>108.0和定性离子对m/z324.9>260.9，相应的碰撞能量分别为10V和6V，碎裂电压105V；CCIM定量离子对m/z217.9>182.9和定性离子对m/z217.9>139.0，相应的碰撞能量分别为18V和24V，碎裂电压120V。

用10mg/L的氟啶胺标准溶液，在电喷雾电离ESI(+/-)方式下进行全扫描(m/z50～600)，以选择适当的分子离子峰和电离方式。结果表明在负离子采集模式下[M-1]峰(m/z462.8)较正离子采集模式下[M+1]峰(m/z464.8)响应高。选择m/z462.8作为母离子进行子离子扫描，通过进一步优化碰撞能量，碎裂电压等参数，分别获得定量离子对m/z462.8>415.9和定性离子对m/z462.8>369.8，相应的碰撞能量分别为20V和35V，碎裂电压100V。

色谱条件，试验表明乙腈+0.1%甲酸水作为流动相，流速为0.3mL/min，乙腈+0.1%甲酸水溶液体积比为70：30时，有效成分与杂质能得到很好的分离，峰型对称，基线平稳。标样色谱图(图1)。

图1 溶剂标样色谱图(氰霜唑及CCIM 0.1mg/L氟啶胺0.2mg/L)

2.2 前处理方法摸索 分别选用PSA、石墨化炭黑(GCB)和C18作为净化剂，通过实验发现PSA、C18和GCB对氰霜唑没有明显吸附，PSA和GCB对氟啶胺大约有30%左右的吸附，GCB对CCIM的吸附达到90%以上，PSA对CCIM的吸附大约有50%。综合结果分析最终选定C18为净化剂，C18能较好的去除大白菜中的干扰杂质，取得良好的净化效果。

2.3 氰霜唑、CCIM、氟啶胺线性关系 将氰霜唑(10mg/L)、CCIM(10mg/L)和氟啶胺(20mg/L)的标准混合溶液用乙腈依次稀释配的1、0.5、0.1、0.05、0.01mg/L(氰霜唑、CCIM)；2、1、0.2、0.1、0.02mg/L(氟啶胺)的系列标准混合溶液。按1.4色谱条件进样，每个质量浓度重复3次，以标准溶液浓度与定量离子对峰面积做标准曲线，线性关系良好。CCIM线性方程Y=5 817.2X+67.7，相关系数(r)为0.999 7；氰霜唑线性方程Y=17 327.0X+139.8，相关系数(r)为0.999 8；氟啶胺线性方程Y=1 128.9X+216.4，相关系数(r)为0.990 9。

2.4 氰霜唑、CCIM、氟啶胺添加回收率和精密度 在空白大白菜中按照0.01、0.1、1mg/kg水平添加氰霜唑及CCIM标准溶液，按照0.02、0.2、2mg/kg水平添加氟啶胺标准溶液，每个浓度5次平行试验，进行添加回收试验。结果表明(表2)：在0.01～1mg/kg添加水平范围内，氰霜唑及其代谢物(CCIM)在大白菜中平均添加回收率分别为93.6%～97.2%和87.3%～103.3%，相对标准偏差分别为3.4%～10.6%和2.6%～4.5%。在0.02～2mg/kg添加水平范围内，氟啶胺在大白菜中平均添加回收率为95.0%～108.1%，相对标准偏差为4.4%～5.8%，符合农药残留分析要求。目标峰无杂质干扰，峰型好(图2)。

2.5 方法检出限、定量限 以最小线性浓度按照3倍信噪比计算得出氰霜唑、CCIM和氟啶胺的最小检出量(LOD)分别为5.3×10-5ng、1.9×10-4ng和9.2×10-4ng，以最小添加水平作为方法的定量限(LOQ)，大白菜中氰霜唑和CCIM的最低检出浓度均为0.01mg/kg;氟啶胺的最低检出浓度为0.02mg/kg。

表2 大白菜中氰霜唑、CCIM和氟啶胺的添加回收率及相对标准偏差

图2 大白菜中添加色谱图(氰霜唑及CCIM 0.1mg/kg氟啶胺0.2mg/kg)

3 结论

本文采用QuEChERS方法提取、净化、LC/MS/MS法快速检测大白菜中氰霜唑及其代谢物(CCIM)和氟啶胺的残留分析方法，样品经乙腈提取，C18净化，高效液相色谱串联质谱仪检测。氰霜唑、CCIM在大白菜中的最低检测浓度为0.01mg/kg，氟啶胺在大白菜中的最低检测浓度为0.02mg/kg，平均回收率在87.3%～108.1%之间。该方法具有重现性好，简单、高效、低成本等特点，能够满足农药残留分析的要求，同时也可为其他农产品及食品中氰霜唑及氟啶胺的残留检测提供参考依据。