调节曲霉属真菌毒素合成的群体感应分子机制的研究进展

彭梦雪 梁志宏

（北京食品营养与人类健康高精尖创新中心 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京100083）

曲霉属（Aspergillus spp.）真菌隶属于半知菌亚门（deuteromycotina）丝孢纲（hyphomycetes）丝孢目（hyphomycetales）丛梗孢科（moniliaceae），广泛分布于土壤、空气和农作物中，属内常见菌种主要有黄曲霉（A.flavus）、赭曲霉（A.ochraceus）、烟曲霉（A.fumigatus）、灰绿曲霉（A.glaucus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、土曲霉（A.terreus）和杂色曲霉（A.versicolor）等[1-2]。曲霉属真菌产生的毒素污染食品、饲料及药物，人或动物摄入后可引起肝、肾毒性、生殖毒性、致癌和致突变性等[3-4]。曲霉属真菌在土壤中以分生孢子或菌核的形式存在，在植物组织中则以菌丝体的形式存在。菌核能在极端胁迫环境条件（高温、干旱等）下存活，并能产生分生孢子或子囊孢子。环境因子包括温度、pH、光照、脂类、宿主蛋白及酚类化合物等均会影响曲霉属真菌的菌丝生长、孢子产生和毒素合成[5]。研究者对曲霉属真菌毒素的生物合成相关基因、关键酶及调控因子、代谢通路、环境影响因子以及阻控毒素危害等方面开展了大量的研究[3，6-7]。迄今为止，参与黄曲霉毒素生物合成的一系列基因、酶及部分调控因子已基本清楚，而其它曲霉毒素，例如赭曲霉毒素的生物合成机制尚不清晰，还不能有效控制粮食中曲霉属真菌毒素的产生。

群体感应（quorum sensing，QS）是微生物间通过释放一些特定的小分子化学物质，并感知其浓度变化，来监测群体密度并调控自身的某些生理行为，从而适应周围环境的一种信号交流机制，又称为“自动诱导（autoinduction）”或“细胞与细胞的交流（cell to cell communication）”。群体感应现象最早于20 世纪70年代，在费氏发光弧菌（Vibrio fluvialis）[8]中发现，细菌可通过群体感应通信机制，调节其菌相转换、毒力因子产生、生物膜形成、生物发光等生理活动[9]，进而适应环境的变化。在真菌中也发现类似于细菌群体感应的密度依赖性调节现象，许多动植物致病菌如白色念珠菌（Candida albicans）[10]、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、腐榆角藻菌（Ceratocystis ulmi）[12]等，可通过群体感应诱导毒力因子的分泌，增强其入侵动植物的能力。此外，曲霉属真菌的形态建成和次级代谢物的产生，也与群体的密度密切相关。黄曲霉以密度依赖的方式调节菌核、孢子以及黄曲霉毒素产生，其中低密度群体产生更多的黄曲霉毒素，并可以增加菌核，降低分生孢子产生；随着群体密度的升高，曲霉属真菌表型发生逆转，产生的菌核减少，分生孢子增加，毒素产量降低[13]。在赭曲霉中也发现类似于黄曲霉的群体密度依赖性现象，将不同密度的赭曲霉孢子分别接种到马铃薯葡萄糖肉汤培养基和花生、玉米、大豆、小麦中，低密度接种情况下赭曲霉毒素A 生物合成相关基因pks的表达量更高，产生更多的赭曲霉毒素A[14]。

随着分子生物学新理论和新技术的发展，尤其是基因组学和生物信息学等研究的快速发展，许多研究对曲霉属真菌毒素生物合成的分子机制做了很多探索，其中包括群体密度依赖性的调控机制。本文以黄曲霉、赭曲霉、烟曲霉、寄生曲霉等产毒曲霉为例，评述调控其毒素产生的群体感应分子机制的相关因素，包括信号分子（主要是脂氧合物）、G 蛋白偶联信号途径以及氧化应激，旨在为深化曲霉属真菌的有毒次级代谢产物的生物合成机制研究提供参考。

1 曲霉属真菌中的群体感应现象

真菌群体感应现象研究最多的是人类致病菌白色念珠菌（Candida albicans）。长期以来观察到，白色念珠菌细胞密度较低时呈丝状生长，而密度较高时以出芽酵母形态生长，其信号分子是法尼醇（farnesol）[15]、酪醇[16]等。此外，还在酵母[17-18]、新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）[11]、曲霉属真菌[13]中发现群体感应现象。曲霉属真菌菌体的形态建成和次级代谢产物的产生与群体密度有关。黄曲霉以密度依赖方式繁殖，在低群体密度时菌核产量增加，分生孢子减少，黄曲霉毒素产量较高，高群体密度时则相反。

目前发现的曲霉属真菌群体感应信号分子主要是脂氧合物（oxylipins）[19]，其信号转导的途径是G 蛋白偶联信号途径。在构巢曲霉中，发现G 蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors，GPCRs）参与了与次级代谢，性发育，应激信号和氨基酸代谢相关的基因调控[20-21]。在这些GPCRs 缺失的真菌中观察到代谢转变，并引发应激反应，这反映调节环境变化的代谢反应的微调机制[20]。对烟曲霉G蛋白偶联受体GprC 和GprD 的缺失突变体的转录组分分析表明，参与初级代谢的基因下调，而几个次级代谢基因簇的转录水平升高[22]。虽然早已发现曲霉属真菌的群体密度依赖性的现象，但是其群体感应信号分子和信号转导机制仍然有限，需要表征和鉴定更多的信号分子，以阐明曲霉属真菌的群体感应信号调节机制。

2 曲霉属真菌的群体感应信号分子

脂类物质及其氧化产物（脂氧合物）与曲霉属真菌毒素的合成具有密切的联系，曲霉属真菌感染油料作物种子或含油脂高的组织之后会产生更多的毒素[23]。脂氧合物是多不饱和脂肪酸通过酶促或非酶促反应产生的氧合脂质，是丝状真菌、酵母、植物和动物信号转导途径的重要信号分子[19，24]。脂氧合物（oxylipins）在曲霉属菌株中统称为性诱导因子（precocious sexual inducer，psi），调节曲霉属菌株的无性和有性发育之间的平衡。

曲霉属真菌中存在脂氧合酶（lipoxygenase，EC 1.13.11.12，LOX）同工酶，催化脂肪酸代谢产生脂氧合物，调控曲霉属真菌的分生孢子、菌核和次级代谢物产生[25]。LOX 是脂肪酸代谢途径的关键酶，其主要作用是催化多不饱和脂肪酸（如亚油酸、亚麻酸及花生四烯酸等）的加氧反应，脂肪酸氢过氧化物，此过程称为LOX 途径或十八碳酸途径[26]。LOX 及其代谢产物可影响曲霉属真菌侵染作物种子的进程，通过参与调控曲霉属真菌和种子互作而不同程度地影响曲霉属真菌生长和产毒，从而影响种子的黄曲霉毒素污染水平。黄曲霉的LOX 与Ppo 蛋白 （psi factor-producing oxygenases，psi-氧合酶） 一起参与群体感应的调节作用。Lox 或PpoC 突变会改变密度依赖性的菌核和分生孢子的产生：在细胞高密度（＞105个孢子/板）条件下，与野生型分生孢子增多和菌核减少相比，突变体的菌核增加而分生孢子减少[27-28]。

真菌的脂氧合物与动、植物的脂氧合物结构与功能相似，这是脂氧合物作为曲霉-宿主互作信号分子的重要特征[29-30]。植物来源的脂氧合物，如13S-HPODE（hydroperoxyoctadecenoic acid，HPODE）和9S-HPODE，不仅参与植物生长发育和防御反应，而且影响黄曲霉属真菌、寄生曲霉属真菌和构巢曲霉的营养生长、分生孢子和菌核的形成及次级代谢产物合成[31-32]。Burrow 等[32]研究发现，培养基中加入低浓度的9S-HPODE、13S-HPODE 均能促进曲霉属真菌孢子的形成，而对曲霉属真菌产毒具有不同作用，低浓度的13S-HPODE（10 μmol/L 和100 μmol/L）能抑制寄生曲霉属真菌和构巢曲霉属真菌中黄曲霉毒素合成基因的表达，并能显著降低其黄曲霉毒素的产量，而相同浓度的9S-HPODE 不能抑制产毒。

脂氧合酶合成相关基因ppo（存在于真菌）和lox（存在于植物、动物和真菌）编码合成的加氧酶类及其氧化产物（脂氧合物）具有调控曲霉属真菌生长发育和产毒的作用[27]。构巢曲霉的ppo 基因敲除后，其有性与无性发育之间的平衡被打乱。同时敲除黄曲霉ppo 基因 （ppoA，ppoB，ppoC 和ppoD）以及另一种产生脂氧合物的基因lox，可破坏黄曲霉的正常形态发育，即使群体密度从低到高变化，菌核也不会转变为分生孢子，且这些敲除ppo 和lox 基因的黄曲霉侵染玉米和花生种子后，黄曲霉毒素产量增加。此外，ppoC 和lox 敲除突变菌株，在任何群体密度下均产生高水平的黄曲霉毒素[27-28]。

其它脂氧合酶代谢产物，如茉莉酸甲酯[33]，六碳醛和九碳醛、醇及其相应酯类[34-35]等可作为启动植物防御机制的信号分子，介导植物抵抗病原菌侵染等过程。Zeringue 等[36]研究发现，抗黄曲霉玉米品种产生的挥发性醛浓度显著高于染病品种。这些脂氧合酶代谢产物可直接或间接地影响真菌生长和产毒，从而提高作物抗真菌毒素污染的能力。

3 G 蛋白偶联信号途径

G 蛋白偶联信号途径是真核生物中普遍存在的细胞跨膜信号转导途径，参与识别并转导多种胞外信号分子，对真菌的生长、分化、繁殖、致病性及真菌毒素等次生代谢产物合成有重要的调控作用[37]。外部的信号分子由G 蛋白偶联受体（Gprotein coupled receptors，GPCR）识别，通过异源三聚体G 蛋白（heterotrimeric G protein，简称G蛋白，含3 个亚基Gα、Gβ、Gγ）完成信号转导[38]，调节cAMP 通路，调控下游反应。

G 蛋白偶联系统由4 部分组成：G 蛋白偶联受体（GPCR）、G 蛋白、下游效应因子（如cAMP）以及信号调节蛋白[21，39-41]。GPCR 是一个非常庞大的跨膜受体家族，其功能和序列具有多样性。在真菌中已发现存在于哺乳动物中的几类GPCR[42]，它们结构的共同特征是含7 个跨膜结构域和与异源三聚体G 蛋白相互作用的结合位点。G 蛋白偶联受体传递信号的基本原理[43]是：特异性的配体（信号分子）与相应的GPCR 结合，引起GPCR 构象的变化；GPCR 构象变化之后能够结合三聚体G 蛋白（此时Gα亚基结合1 个GDP 分子），并诱导G 蛋白的Gα亚基构象发生变化，使Gα亚基释放结合的GDP，并迅速与周围环境中的GTP 结合；结合了GTP 的Gα亚基立即与GPCR 和Gβγ亚基复合物分离；Gα亚基和Gβγ亚基分别与下游的效应蛋白结合，通过调控效应蛋白的活性来实现信号的转导；Gα亚基与效应蛋白结合后，GTP 水解成为GDP，并与Gβγ亚基形成三聚体，等待下一次信号转导。

曲霉属真菌可通过GPCR 来感测环境中营养源、发育信号、应激压力及来自其它生物体的信号的变化[44]。黄曲霉和其它丝状真菌的GPCR 敲除后，突变体的生长发育和次生代谢受到破坏。在黄曲霉gprC 和gprD 突变体中发现，gprC 和gprD 的敲除使得高群体密度表型向低群体密度表型的转变能力受损，即使在不利的高群体密度下，两种菌株也产生较高水平的菌核和黄曲霉毒素[13]。此外，脂氧合物可以引起构巢曲霉中cAMP 水平显著升高，并且构巢曲霉G 蛋白偶联受体gprD 基因的丧失可阻止这种cAMP 积聚。2012年，Affeldt 等[13]构建了10 种GPCR 突变体，发现GprD 负责识别13S-HPODE、9S-HPODE、13S-HODE（hydroxylinoleic acid，HODE）和9S-HODE。在黄曲霉中开发了一种GPCR 敲除的文库，gprA，gprB，gprF，gprG，gprM，gprP，gprP 或gprR 敲除的菌株对外源性茉莉酮酸甲酯（一种植物的防御性脂氧合物）的作用无应答。gprA，gprC，gprD，gprF，gprG，gprJ，gprO 或gprP 被敲除的突变体仍然应答于亚油酸而形成孢子，而对诱导孢子形成的氧脂素13S-HPODE 无应答[44]。

G 蛋白偶联信号途径可以作为改进利用微生物来生产酶类和其它次生代谢产物的生物技术的重要靶标。由于这一途径也显著影响了菌株的生长发育，因此应考虑靶分子改变后的副作用，如引起菌株生长缺陷，丧失生殖能力或改变毒素产生等。

4 曲霉属真菌毒素合成应答于氧化应激压力

真菌侵染宿主后，宿主产生活性氧（ROS）作为防御武器，诱导真菌细胞死亡[45]。在曲霉属真菌中，抗氧化酶的产生是抵抗胞内ROS 形成的第1道防线，而次级代谢物的合成则是作为抵抗ROS伤害的第2 道防线[46-48]。丝状真菌已经开发出复杂而成熟的应答系统以避免氧化损伤。在许多丝状真菌（包括黄曲霉、寄生曲霉、米曲霉和构巢曲霉）中发现，氧化应激与毒素生物合成之间有密切的联系[45，48]。氧化应激可以刺激黄曲霉中的黄曲霉毒素[49]，赭曲霉中的赭曲霉毒素A[50]，禾谷镰刀菌中的单萜烯B[51]的积累。具有抗真菌活性的抗氧化剂（例如多酚），是曲霉属的真菌毒素生物合成的抑制剂[52]。据报道，酚类抗氧化剂如咖啡酸或绿原酸，是几种曲霉属的赭曲霉毒素A 产生的有效抑制剂[53]。

真菌可通过产生次生代谢物来抵抗氧化应激压力所带来的损伤，许多属于bZIP 转录因子家族的蛋白质，协调氧化应激与次级代谢之间的相互作用。bZIP 蛋白（如AtfA，AtfB，ApYapA 及其同系物NapA） 在丝状真菌的生命史中起普遍的作用，它们调节氧化应激反应，次生代谢以及形态发育[48]。在寄生曲霉中，atfB 表达不仅与黄曲霉毒素生成相关，还结合黄曲霉毒素生物合成基因的启动子以及应激反应基因[54-55]。此外，在黄曲霉毒素生产过程中同时发生黄曲霉毒素生物合成基因转录物以及atfB 转录物的积累[55]。AtfB 可以促进nor-1（一种黄曲霉毒素生物合成基因）的转录。寄生曲霉apyapA 敲除突变体对细胞外源氧化剂的易感性增加，该突变体的活性氧水平和黄曲霉毒素产量均增加[55]。构巢曲霉的DApyap1 突变菌株对玉米种子的致病性增加，更早、更多地产生了黄曲霉毒素。构巢曲霉的apyapA 同系物napA 过表达时，突变体更耐受氧化应激，次级代谢产物合成降低[49]。另一种bZIP 蛋白，氮调节的MeaB 蛋白，可调节毒力和次级代谢[56]。当黄曲霉属真菌株的MeaB 过表达，其定殖于种子类宿主的能力降低，脂肪酶活性降低，并失去黄曲霉毒素合成能力。

真菌病原体氧化应激和次生代谢产物之间的密切关系，可以解释为植物宿主与真菌互作所产生的适应性机制。真菌侵染宿主后，激活具有解毒活性的抗氧化剂的表达来克服植物的防御性氧化应激压力。例如，禾谷镰刀菌产生B 型头孢霉素[51]，赭曲霉产生赭曲霉毒素[14]等。次生代谢产物如核黄素的生物合成，是真菌清除ROS 的机制，在真菌存活中起作用[57]。真菌毒素的生物合成可能有助于真菌细胞维持细胞内ROS 的安全水平。

虽然真菌毒素生物合成的调节与氧化应激之间的联系远未完全阐明，但是这种相互作用为工业大规模生产次生代谢产物（例如抗生素）或控制作物中霉菌毒素的积累提供了广阔的前景。例如，一些酚类的抗氧化剂通常在许多植物（包括谷物）中大量存在，这些抗氧化剂可以负调节毒素生产[52]。控制这些抗氧化剂在作物中的含量，可能有助于调控食物和饲料中霉菌毒素。

5 总结与展望

曲霉属真菌在自然界中分布广泛，是人、动物及植物的共同病原菌，其产生的毒素污染不仅制约农业生产的发展，而且产生严重的食品安全问题。群体感应分子机制可以调节曲霉属真菌的生长发育和次级代谢，然而目前对曲霉属真菌的群体感应研究仍然处于初级的阶段，其信号转导途径有关的信号分子、受体、下游调控通路的靶分子等仍然不清晰。目前发现的曲霉属真菌群体感应的信号分子主要是脂氧合物，其受体是G 蛋白偶联受体 （GPCRs），G 蛋白信号通路基因的突变影响孢子形成和霉菌毒素的产生。不饱和脂肪酸通过脂氧合酶 （LOX） 的催化产生脂氧合物，lox 和ppo 可以编码合成加氧酶类及脂氧合物，具有调控曲霉属真菌生长发育和产毒的作用。氧化应激反应相关的基因表达与真菌毒素生物合成之间有密切的联系，真菌可能通过合成毒力因子来应对活性氧水平的升高，bZIP 转录因子家族的蛋白质可协调氧化应激与次级代谢之间的相互作用。

目前仍然存在一些值得深究的问题。①曲霉属真菌的群体感应现象是否与氧化应激水平有关？真菌毒素的生物合成与群体感应、氧化应激均相关，这三者间的关系及这些现象之下的生物学机制如何仍然不清楚。②曲霉属真菌在与植物寄主互作过程中，是如何利用寄主的脂氧合物（作为信号分子）和应对寄主升高的氧化应激压力？植物对真菌的入侵有抵抗防御的能力，其中升高其体内活性氧水平可能是机制之一；而真菌也会进化出有利于其自身生存的抵抗机制，其可能通过合成一些次级代谢产物（如真菌毒素）来适用寄主的氧化应激压力。这些问题的解答将有助于人们加深对曲霉属真菌毒素生物合成机制及其生物学意义的理解，能够为研究控制粮食中的真菌毒素的生物合成的抑制剂提供靶向信号通路或靶分子。