乳品中有害微生物检测技术的研究进展

陈嘉惠，陈沁，钮冰

（上海大学生命科学学院，上海201900）

0 引 言

乳品在人们的膳食结构中具有十分重要的地位，乳品富含人体所需的蛋白质、脂肪、糖类和维生素等营养物质[1]。乳品营养丰富，同时也是微生物的良好培养基，微生物污染引起的乳品安全事件频繁发生，2002年美国FDA在乳品巨头企业所生产的婴幼儿配方奶粉中，检测出阪崎肠杆菌；2008年法国宝怡乐公司生产的一批婴幼儿奶粉被召回，这一批次产品可能受到沙门氏菌污染；2011年我国国家质检总局在蒙牛公司生产的一批纯牛奶中检测出黄曲霉毒素M 1含量超标。乳品安全意义重大，它对消费者的健康产生严重影响，还与中国乳品、食品行业，甚至国际形象息息相关[2]。因此，完善乳品中有害微生物的检测技术，对于提高乳品的质量安全和确保消费者的健康问题具有重要的意义。

1 乳品中常见有害微生物

1.1 腐败型微生物

乳品中常见腐败型微生物可分为细菌和真菌两大类，细菌又可分为耐热菌与嗜冷菌。乳品中污染能力较大的耐热菌为部分异型乳酸菌，这些异型乳酸菌具有一定的抗热性，60℃下可存活20分钟，当其出现在密闭条件下的原料乳中时，会大量增殖导致原料乳的酸败，这种污染后的原料乳不能用来生产超高温瞬时灭菌乳（Ultra High Temperature treated，UHT），而发酵乳被这些异性乳酸菌污染时，会产生一些不良的风味物质，导致乳品变质而不能食用；乳品中常见的耐热菌还有芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌等，芽孢杆菌属能分解生乳中的蛋白质和脂肪，不仅会产生腐败味，还会导致鲜奶产气。嗜冷菌同样是乳品中的腐败菌，国际乳品联合会（International Dairy Federation，IDF）提出，凡是在7℃以下能生长的细菌为低温菌，而在20℃以下能繁殖的细菌为嗜冷菌。乳品中的嗜冷菌有：假单胞菌属、醋酸杆菌属、明串珠菌属、气单胞菌属等[3]，以假单胞菌属中的腐败假单胞菌为例，腐败假单胞菌可从水和土壤中分离得到，是一种兼性厌氧菌，其代谢产生的脂肪酶和蛋白酶是最耐热的，会导致超高温瞬时灭菌乳（UHT）在贮存期内产生结皮、变味、脂肪上浮等现象。乳品中另一大类腐败型微生物为部分真菌，食品被其污染后会腐败变质，产生大量的真菌毒素，误食可导致中毒。黄曲霉是这类真菌的典型代表之一，其代谢产物是黄曲霉毒素，是真菌毒素中较常见的毒素，可导致DNA损伤，并具有遗传性，其中黄曲霉素M 1常存在于乳制品中，毒性较强[4]。1993年世界卫生组织（WHO）和国际癌症研究所将黄曲霉素确定为一级人类致癌物。

1.2 致病型微生物

致病型微生物的主要类型有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和阪崎肠杆菌等[5]。金黄色葡萄球菌是一种广泛存在于自然界的致病菌，革兰氏阳性菌的代表，其污染食物的主要原因是能产生对热稳定的肠毒素，可引起恶心、腹泻严重时可导致呼吸困难和休克等症状；大肠杆菌是人和部分动物肠道内最主要的一种菌，部分菌株具有致病性，是重要的食源性致病菌，其中毒力较强的是肠出血性大肠杆菌，食用其污染的乳品后，会导致严重的腹痛与腹泻，重者可能引起便血与高热，同时大肠杆菌是乳品国家标准规定中主要的检测菌群；沙门氏菌是重要的食源性致病菌之一，分布较为广泛，大多数菌能产生内毒素，所以对人体和其他动物有致病性，受其感染的人和动物会出现伤寒、副伤寒等病症，一旦进入血液组织，则会导致系统性炎症，甚至死亡[6]；阪崎肠杆菌属于肠杆菌科，主要寄生在人和动物的肠道内，婴幼儿食入阪崎肠杆菌污染的乳粉，可能导致脑膜炎、败血症及新生儿坏死性小肠结肠炎等症状[7]。我国2010新修订的《食品安全国家标准婴幼儿配方食品》GB 10765-2010，已将阪崎肠杆菌列入微生物限量控制指标[8]。致病型微生物主要通过奶牛进入乳制品中，加工过程中消毒或杀菌不彻底会导致污染的扩散，从而引起乳及乳制品变质，食用后会引起中毒等一系列症状。

2 乳品中微生物的检测技术

2.1 计数法

我国比较传统的微生物检测方法主要包括标准平板计数法（SPC）和显微镜直接观察法（DMC）两种方法。它的原理是对活菌的总数进行测定，我国现行国标GB/T 4789.2—2016规定采用以上两种方法对菌落总数进行测定[9]。这两种方法的优点是设备简单、成本低廉，因此受到了社会各大企业和质量监督检测部门的普遍欢迎。缺点是操作烦琐、检测周期长，且灵敏度相对较低，无法检测乳品中全部的微生物，因此检测效果较差[10]。在传统计数法基础上，Margot[11]等人开发了一种新型显色培养方法，用以快速检测沙门氏菌，结果显示该方法对沙门氏菌的特异性可以达到100%，可用于乳品中沙门氏菌的检测，与标准方法比缩短了检测时间。除此之外，Teramura[12]等人对市售的四种显色培养基进行比较，以建立检测乳粉中阪崎肠杆菌的标准方法。显色培养方法与传统计数法相比，提高了灵敏度和检测效率，常用于乳品中沙门氏菌、阪崎肠杆菌和李斯特氏菌的检测。

2.2 免疫学检测技术

2.2.1 ELISA法

酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay,ELISA)是一种将抗原、抗体免疫反应的特异性与酶催化作用的高效性有机结合起来的方法。Portanti[13]等人根据单克隆抗体原理建立的一种新型捕获ELISA法用于识别食品中单核细胞增生李斯特氏菌，其中包括乳制品的检测，实验结果表明该法对李斯特氏菌属具有100%的特异性，与国际组织的标准化相比，具有显著的一致性。Yazdankhah[14]等人将ELISA方法与免疫磁性分离技术联用检测牛奶中的金黄色葡萄球菌，最低检测限为1×105CFU/mL，检测时间为3小时，这种联用技术极大的提高了检测效率。ELISA方法目前已被开发成商品化试剂盒，用于乳品安全检测，其优点是灵敏度很高，所得结果与标准平板计数法相似、操作简便快捷以及受样品干扰小，适用于食品中微生物和生物毒素的快速检测。但也存在着一些缺陷，比如检测过程中样品中若存在结构类似的化合物则可能发生交叉反应，检测分子量较小或很不稳定的化合物时有一定的困难，随着酶联免疫技术的不断完善和发展，该技术将会得到进一步的发展。

2.2.2 免疫荧光技术

免疫荧光技术（Immunofluorescence）也称荧光抗体技术，是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来鉴定和检测细胞或组织切片中相应抗原（抗体）的方法。该技术是由Nerurkar等[15]在1984年建立的，可用来检测沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素、E·Coli O 157。Song[16]等人提供了一种使用无标记免疫荧光条传感器检测大肠杆菌O 157∶H 7的快速简单方法，将荧光素异硫氰酸酯（FITC）加入到样品培养基中以制备用于无标记条带传感器的荧光探针，并保持与针对大肠杆菌O 157∶H 7的单克隆抗体的良好亲和力，当样品中存在大肠杆菌O 157∶H 7时，富集激发后会发出黄绿色荧光，当样品溶液迁移到条带的末端时，荧光细菌与捕获抗体结合，从而在测试区域上形成可见的黄绿色线，这种方法检测迅速，可用于现场快速检测。免疫荧光技术的主要特点为特异性强、快速简便、灵敏度高及测试费用低。然而，这种方法在交叉反应、假阳性、非特异性染色等问题上仍需要进行改进。

2.2.3 免疫胶体金技术

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)是一种新型免疫标记技术，其原理是以胶体金作为示踪标记物，结合抗原抗体反应，进行定性或半定量的快速检测。1971年Faulk和Taytord[17]首次将胶体金引入免疫学，用来研究沙门氏菌菌壁细胞抗原成分。随着该技术的发展，Rong[18]等建立了一种基于多克隆抗体的胶体金试纸条检测方法，用于检测金黄色葡萄球菌肠毒素B，该方法在缓冲液中检测限为1 ng/mL，在牛奶中检测限为10 ng/mL，灵敏度较高。目前，沙门氏菌抗原、李斯特菌抗原等可用专门的商品化检测卡进行检测，此种方法灵敏准确、快捷迅速、安全简便且不需任何设备和仪器，只需制备好试剂盒或测试条即可。与ELISA方法相比，胶体金本身具有颜色，省略了添加显示液和终止液的步骤，简化了操作，更适合于野外或现场应用。

2.3 ATP生物荧光技术

ATP生物荧光检测技术原理是将微生物内自由的可溶解的ATP释放出来，在有荧光素酶等存在条件下与虫荧光素发生反应产生荧光，通过荧光信号的强弱计算出ATP的含量，推算出样品中的含菌量。1970年，Sharpe等[19]首次利用ATP生物荧光技术检测了牛奶中细菌含量，随后这个方法很快应用到不同种类的乳品中微生物含量的检测，如Samkutty等[20]利用ATP生物荧光技术预测了原料乳中的总菌数，所得结果与平板计数法所得结果的相关性约为80%。Cunha等[21]人应用ATP生物荧光技术评价超高温灭菌乳中微生物的含量，实验采用三种不同成分的培养基对乳品中微生物进行培养，不同培养基的平板计数结果与ATP生物荧光技术结果皆有显著相关性。两者实验结果也证明了ATP生物荧光技术可用于不同加工方式乳品中微生物含量的检测。与传统的检测技术相比，ATP荧光检测技术的优势是无需进行微生物培养，检测速度快，操作简便，低端手持型ATP生物荧光检测仪仅需一人即可完成所有检测；缺点是低端检测仪灵敏度较低，效果不太理想；高端检测仪相关试剂较贵；检测过程中受游离ATP、体细胞以及盐等成分干扰。

2.4 流式细胞检测法

流式细胞术的原理是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现细胞的定量分析和分选。流式细胞仪由液流系统、光学系统、电子系统、分析系统等构成设备的主要部分。Cassoli等[22]使用流式细胞检测法和标准平板计数两种方法对来自于100个农场并存储24，48或72小时后的散装牛奶进行分析，结果显示这两种方法的相关性极高并由此建立了一种转换关系，最后评估了它们之间的转换关系，不受样品存储时间的影响。Ikeda[23]等人将微流控芯片技术和荧光原位杂交技术应用到流式细胞检测法上，用于快速鉴定牛奶中的单核细胞增生李斯特氏菌。与标准平板计数法相比，流式细胞检测法有许多优势，该技术无需进行样品的前期制备和培养，节省了大量的时间、人力和物力等，在现代化快速生产要求越来越高的今天，该技术十分实用。该技术的弊端是前期投入相对较高，样品处理以及荧光染料的选择会影响检测结果，且流式细胞仪价格较高，日常维护费用也相对昂贵，并且对操作人员专业素养要求相对较高。

2.5 PCR技术

2.5.1普通PCR技术

1983年Millus等[24]发明了PCR(Polymerase chain reaction)技术，该技术可以通过特异性地扩增某种微生物的基因片断而实现快速检测。马冬等[25]用大肠杆菌人工污染乳样品，对污染前后全脂乳和脱脂乳中的大肠杆菌应用PCR扩增技术进行检测，检出限分别为104CFU/mL，1 CFU/mL，实验证实PCR法用于乳品中大肠杆菌检测的可行性。但是要达到实际应用，还应对可能存在于乳品中的其他微生物对PCR反应特异性的影响进行更深入的研究。Amagliani[26]等人采用基于DNA磁性捕获的PCR法，检测了巴氏灭菌全脂乳中的单核细胞增生李斯特氏菌，检测限达到10 CFU/mL，该方法显示出较高的特异性和灵敏度。与传统检测方法相比，PCR技术最大的特点是快速、准确，简便。通常在几小时内便可完成对微生物的测定。但缺点是其在检测中不能区分活细胞和死细胞，并且仅限于核酸序列已知的微生物的鉴定，同时其定量能力较差。

2.5.2 多重PCR技术

多重PCR(multiplex PCR)的原理是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，可以对大肠杆菌、沙门氏菌和致病性弧菌等几种微生物进行同步检测。Nandi等人[27]使用两重PCR检测牛奶中腹泻性大肠杆菌的2个重要毒素基因，产生志贺毒素的大肠杆菌（STEC）和产肠毒素大肠杆菌（ETEC）的stx2和elt基因，多重PCR可快速和有效地检测牛奶中的STEC和ETEC，证明了多重PCR在乳品微生物检测上的便利性。刘继超等人[28]应用三重PCR对原料乳中沙门氏菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌进行了研究，使用该方法检测的30份乳品样品中，沙门氏菌检出率为46.7%，无乳链球菌检测率为53.5%，金黄色葡萄球菌检测率为50.0%，与国标方法的检测结果完全一致，检测结果验证了多重PCR方法具有良好的可行性和实用性。多重PCR方法将传统方法中大量的生化试验转化为一次性扩增，便于批量检测，结合国家标准或行业标准，使用多重PCR方法对乳品样品进行致病微生物初筛，可大大缩短检测周期，降低检验成本，在乳品污染型微生物、致病型微生物及环境微生物检测中具有重要作用，具有较好的应用前景。但该方法容易出现假阴性的结果，故应用时需要改进样品处理技术、去除食品抑制因子干扰，同时与其他技术整合应用。

2.5.3 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR(Real-time fluomgenetic quantitative PCR)也可应用到乳品微生物的检测中。Graber[29]等采用实时荧光定量PCR成功检测了患乳房炎奶牛的牛乳中致病菌金黄色葡萄球菌的数量。Paul[30]等人将该技术用于检测生乳中大肠杆菌O157，并且在总测定时间3小时内获得1 CFU/mL的检测极限。荧光定量PCR技术的发明比定性PCR技术晚出现10年，相对于定性PCR来说，其具备荧光定量重复性好、稳定性能高、特异性强的特点。缺点是容易出现假阳性结果且仪器和试剂成本相对较高，当然，实时荧光定量PCR技术的发展，不能与其他传统和分子学方法相脱离，而应与它们结合起来以实现优势互补。有些学者将多重PCR和实时定量PCR结合进行相关检测，Hyeon[31]等开发了一种快速灵敏的多重实时PCR检测方法，用于同时检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌和沙门氏菌，将建立的多重实时PCR系统应用于人为污染的婴幼儿配方奶粉时，沙门氏菌和阪崎肠杆菌的检测限为103CFU/mL，富集24小时后，可以在约0.1 CFU/mL的初始接种水平检测沙门氏菌和阪崎肠杆菌。

2.6 电化学生物传感器检测法

电化学生物传感器是一种由分子识别元件和转换元件组成，以电势、电流等为特征检测信号的传感器。其中，分子识别元件可以是生物体成分或者生物体，而转换元件为电极。Zelada[32]等人将电位测定与核酸适配体结合在生物传感器中以检测半脱脂牛奶中的大肠杆菌，核酸适配体共价结合单壁碳纳米管修饰的电极，与牛奶样品中的大肠杆菌O 157∶H 7相互作用产生电压的变化，从而间接地检测出牛奶中细菌的含量，快速检测线性响应达到104CFU/mL，响应时间为2分钟。Avila[33]等制备了基于功能化磁珠和金丝网印刷电极的一次性安培型磁电免疫传感器，用于特异性检测和定量葡萄球菌蛋白A以及金黄色葡萄球菌，所建立的方法显示出非常低的检测限1 CFU/mL，分析时间为2小时，并且对来自牛奶的最常见的食源性病原体具有良好的选择性。电化学生物传感器是生物传感器中使用最为广泛的一类传感器，它优点是换能器便宜，受检测样品的浊度影响较小，传感器检测过程输出的电信号可直接在电路中转换，降低了仪器的复杂性，有利于仪器的微型化和集成化，常用于现场快速检测。当然电化学生物传感器尚存在一些缺陷，目前传感器制作的不够均一，使设置空白和标准品对照检测的作用降低，并且其识别元件的寿命、稳定性和非特异性结合方面依旧存在一定的局限性，不能完全实现对乳品等复杂体系的实时、在线、超灵敏自动化检测。

2.7 基因芯片技术

基因芯片（Gene chip）技术通常采用原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面，得到DNA探针阵列，然后与标记的样品分子进行杂交，通过杂交信号强度来实现对生物样品的检测。Jin[34]等人构建了基于多重微珠的生物芯片系统，针对乳品中较为常见的八种不同致病菌进行同时检测，将来自乳品微生物的基因片段泵入芯片系统并与特定的寡核苷酸修饰的微珠杂交，由杂交反应产生的荧光信号在30分钟内即可获得，检测范围为500-6×103CFU/mL。Chiang[35]等开发设计了一种新型塑料基因芯片，用于同时检测乳品中较常出现的八种葡萄球菌，结果表明该方法不仅快速、灵敏，而且特异性较高。应用基因芯片技术可以达到高通量、微型化、自动化检测，相比于传统单一的检测方法，生物芯片的优势更加显著，灵敏度高、特异性强、操作简便，可同时检测多种微生物。我国国家生物芯片中心等单位已开发并生产了用于食源性致病菌检测、食源性病毒检测的生物芯片技术平台，包括仪器和试剂盒[36]。然而基因芯片检测技术仍面临着一些问题，样品制备过程复杂，芯片制作昂贵，检测结果不具有标准化等。相信随着芯片制作及杂交条件的不断升级换代，基因芯片技术必将得到更广阔的发展空间。

3 展 望

乳品安全问题一直以来都是人们关注的焦点，乳品受微生物污染的问题日益凸显，成为威胁乳品质量安全的重要原因，乳品微生物检测技术能有效的避免和预防食源性疾病的发生。乳品中微生物的检测方法是多种多样的，且各种方法都有其自身的特点。总体来说，如传统检测方法检测设备简单，成本较低，但实验操作复杂，不利于现场检测；PCR检测技术特异性强，灵敏度高，却易受到样品影响，出现假阳性、假阴性的结果；流式细胞检测技术操作简单、快速，但仪器昂贵，成本较高；基因芯片技术的兴起，从根本上改变了微生物的检测方法，实现了高通量检测，却也存在着样品制作复杂、芯片昂贵等问题。随着分子生物学的发展，一些新的微生物检验方法和技术不断涌现，各项检测技术来到一个新纪元，它们的结合使用、融合发展成为未来乳品微生物检测的趋势。现如今的乳品检测中，人们对智能化、小型化和便携式检测仪器的需求与日俱增，这些小型仪器可实现对乳品的现场检测，它们的生产和研制成了今后乳品微生物检测技术中的另一发展方向。乳品的质量安全与人们的身体健康和生命安全紧密相关，因此需要建立更加高效、灵敏、可靠的微生物检测技术，也是保证中国乳品安全的前提[37]。