稳定剂对灭菌型乳酸菌饮料稳定性影响的研究

孙志岩，郝金伟，张志娟，何卫加，赵晶

（1.东北农业大学黑龙江省绿色食品科学研究院，哈尔滨150028；2.黑龙江东方学院，哈尔滨150066；3.丹尼斯克（中国）投资有限公司上海310000）

0 引 言

乳酸菌饮料主要是以鲜乳或再制乳为原料，杀菌之后接种乳酸菌类物质发酵而成的。灭菌型乳酸菌饮料不仅具有丰富的营养物质和独特的风味，而且还具有调节肠道菌群、改善便秘和腹泻的作用，受到广大消费者的喜爱，目前销售量也在不断地上升[1]。但是灭菌型乳酸菌饮料在销售和存储过程中常出现分层、沉淀等问题，给销售带来了许多的不变，产生这一问题的原因是灭菌型乳酸菌饮料的pH值一般在3.8～4.2，而牛乳中的乳蛋白有80%是等电点为4.6的酪蛋白，使灭菌型乳酸菌饮料处于不稳定状态，因此控制饮料的p H值是至关重要的[2-3]。适合且适当的稳定剂可以提高灭菌型乳酸菌饮料的稳定性，本试验主要是在灭菌型乳酸菌饮料中加入果胶（Pectin888）、海藻酸丙二醇酯（PGA）、大豆多糖（SSPS）来研究单独添加单一稳定剂对灭菌型乳酸菌饮料的pH值、黏度、离心沉淀率、lumi斜率、粒径分布的影响，进而研究其稳定性，并采用响应面方法进行复配，得出最佳的复配方案，为以后研究灭菌型乳酸菌饮料的稳定性提供一些参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂奶粉，雀巢（中国）有限公司；蔗糖，市售；副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）、Pectin888，丹尼斯克（中国）有限公司；PGA，郑州豫龙食品有限公司；SSPS，上海百奥特植物蛋白科技有限公司。

SG 2 pH计，分析天平上海梅特勒-托利多仪器有限公司；M BL25高速剪切机，上楚业生物科技（上海）有限公司；SHP-160生化培养箱、TD 5G离心机，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；APV-1000型均质机，丹麦APV公司；微型UHT杀菌机，上海沃迪实验设备；M astersizer3000激光粒度分析仪，英国马尔文仪器有限公司；V ISCO黏度计，爱拓中国分公司；LumiSizer，上海顺虞科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌型乳酸菌饮料的工艺流程

（1）发酵凝乳的制备[4]

（2）饮料的调配

1.2.2 稳定剂的单因素试验

以灭菌型乳酸菌饮料的pH、黏度、离心沉淀率、Lumi斜率、粒径分布为试验指标，研究Pectin888、PGA、SSPS的添加量对灭菌型乳酸菌饮料稳定性的影响，筛选出最佳条件，进行后续研究。表1为3种稳定剂的不同添加量。

表1 各稳定剂的添加量

1.2.3 稳定剂的响应面优化试验

稳定剂之间的复配可以减少稳定剂的用量，还能避免单一稳定剂添加过量而影响其饮料的风味，考虑到饮料的口感和成本对各稳定剂进行复配[5]。本文以Pectin888（A）、PGA（B）、SSPS（C）为自变量，以黏度、Lumi斜率为响应值，通过响应面优化方法得到最佳稳定剂复配方案，试验方法见表2。

表2 响应面因素水平编码表

1.2.4 稳定性的测定方法

1.2.4.1 酸度测定

使用手持式pH计直接测定灭菌型乳酸菌饮料的酸度。

1.2.4.2 黏度测定

将饮料倒入50 m L烧杯，使用LVI号转子，设置黏度计为25℃，60 rpm下进行测定。

1.2.4.3 离心沉淀率测定

在离心管（60 m L，质量m1）中加入定量样品（质量m0），4 000 rpm下离心15 min，将上清液弃去得m2，以离心沉淀率公式：

离心沉淀率=(m2-m1)/m0×100%[6]

1.2.4.4 Lumi测定

Lumisizer分析仪是通过高速离心使饮料中的蛋白质分子在重力或离心力的作用下发生悬浮或者沉淀，再利用红外照射，得到一个Lumi测定的结果图，该图输出的数据为Lumi斜率，即透光率变化率。灭菌型乳酸菌饮料的稳定性可由Lumi斜率来反映，斜率越大，透光率变化越快，饮料的稳定性越差；反之亦然。测试条件：在25℃，4 000 r/min下保持42 min。

1.2.4.5 粒径测定

利用M astersize2000激光衍射粒度分析仪测定灭菌型乳酸菌饮料的粒径，该仪器可以直接输出粒径分布曲线和粒径分布图。测试条件为：25℃，2 200 r/min。

1.2.5 数据统计与分析

使用O rigin85对实验数据进行处理，并制作曲线图，最后使用Design Expert8.0.5.0软件对Box-Behnken设计试验结果进行回归方差分析[7]。

2 结果与分析

2.1 稳定剂的单因素试验分析

2.1.1 Pectin888对饮料稳定性的影响

（1）Pectin888对饮料pH的影响如图1所示。

图1 Pectin888对饮料pH的影响

由图1可知，随着Pectin888添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料的p H逐渐下降，当添加量为0.4%～0.5%时，p H下降速度变缓。这是因为Pectin888属阴离子多糖，在乳酸菌饮料中与带正电荷的酪蛋白相互吸引并结合，形成酪蛋白-果胶复合物，进而稳定酪蛋白；随着Pectin888添加量的增加，阴离子含量逐渐增多，从而使越来越多的果胶分子被吸附在酪蛋白胶体表面，使饮料的总p H下降。

（2）Pectin888对饮料黏度和离心沉淀率的影响如图2所示。

由图2可知，随着Pectin888添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料的黏度逐渐上升，离心沉淀率逐渐下降，可见蛋白质分子的沉降速度与饮料中胶粒的密度呈正比，与饮料的黏度呈反比。Pectin888添加量从0.4%升到0.5%时，饮料的黏度急剧上升，离心沉淀率缓慢下降，主要是因为Pectin888与酪蛋白之间静电相互作用，吸附周围的酪蛋白，高浓度的Pectin888可以使酪蛋白达到饱和吸附，使蛋白质胶体分子之间产生空间位阻，进而增加饮料的稳定性，又因为Pectin888属于多糖，增加其用量黏度会有显著的增加[8]。

图2 Pectin888对饮料黏度和离心沉淀率的影响

（3）Pectin888对饮料Lumi斜率的影响如图3所示。

由图3可知，灭菌型乳酸菌饮料中的蛋白质分子在分离过程中，随着Pectin888添加量的增加，透光率变化率逐渐减小，沉淀与悬浮分离的速度逐渐变慢，Lumi斜率逐渐减小。由此可见，随着Pectin888的增加，灭菌型乳酸菌饮料越来越稳定。

（4）Pectin888对饮料粒径的影响如图4所示。粒径分布的分析结果见表3。

图4 Pectin888对饮料粒径分布的影响

表3 粒径分布的结果分析

由图4和表3可知，灭菌型乳酸菌饮料中加入Pectin888可以使粒径分布的比较均匀，随着Pectin888添加量的增加，d(0.1)、d(0.5)、d(0.9)的粒径虽然在逐渐减小，但是变化不大，进而说明Pectin888对饮料的粒径没有太大的影响。综合以上结果可见，随着Pectin888添加量的增加，饮料体系的p H、离心沉淀率、Lumi斜率逐渐减小，黏度逐渐增加，粒径分布变化不大，饮料的稳定性越来越好。当添加量为0.4%和0.5%时，各因素的该变量不是很大，从节省原料角度应该，最佳的添加量为0.4%。

2.1.2 PGA对饮料稳定性的影响

（1）PGA对饮料pH的影响如图5所示。

图5 PGA对饮料pH的影响

由图5可知，随着PGA添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料的p H呈先下降再平稳最后上升的趋势。PGA在水溶液中带负电，可以吸附周围的酪蛋白分子，形成一种黏稠的胶体；当添加量超过0.4%时，PGA将会破坏PGA与酪蛋白的相互作用，使pH开始上升[9]。

（2）PGA对饮料黏度和离心沉淀率的影响如图6所示。

图6 PGA对饮料黏度和离心沉淀率的影响

由图6可知，随着PGA添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料的黏度逐渐增加，添加量从0.3%增至0.5%范围内，黏度变化较大。主要原因是因为PGA大部分被羧基酯化，而且还具有亲水和亲油基团，增加了PGA的空间体积，既可以与脂肪球结合，防止脂肪上浮；又可以与酪蛋白形成一种复合体，防止酪蛋白发生沉淀，同时使饮料内部的分子结构排列更加紧密，三维网状结构更加稳定，进而提高饮料的黏度，使其稳定性增加。PGA具有较强的抗盐性，即使电解质的浓度很高也不会发生盐析，并且也不会与钙离子和钠离子发生反应，降低饮料的沉淀率。

（3）PGA对饮料Lumi斜率的影响如图7所示。

图7 PGA对饮料的Lumi斜率的影响

由图7可知，灭菌型乳酸菌饮料中的蛋白质分子在在分离过程中，随着PGA添加量的增加，透光率变化逐渐减小，沉淀与悬浮分的速度逐渐变慢，Lumi斜率逐渐减小。由此可见，随着PGA添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料越来越稳定。

（4）PGA对饮料粒径的影响如图8所示。粒径分布的分析结果见表4。

图8 PGA对饮料粒径分布的影响

表4 粒径分布的结果分析

由图8和表4可知，试验1和2的粒径分布基本一致，分子粒径相对较小，此时最为稳定；试验5的粒径分布较散漫，90%的分子粒径已经达到了26.963，分子粒径较大，此时的饮料很不稳定。由此看来，从粒径分布角度来看，试验2分布较为合理，其主要原因可能是：PGA添加过量，酪蛋白吸附的PGA分子量增加，胶粒体积增加，静电排斥作用不足以使各蛋白质分子稳定存在，一些蛋白质分子最终聚集在一起，使得大粒径分子增加。因此，PGA的最佳添加量为0.2%。

2.1.3 SSPS对饮料稳定性的影响

（1）SSPS对饮料p H的影响如图9所示。

由图9可知，随着SSPS添加量的增加，产品p H值逐渐上升，但是整体变化量并不显著。

（2）SSPS对饮料黏度和离心沉淀率的影响如图10所示。

图9 SSPS对饮料pH的影响

图10 SSPS对饮料黏度和离心沉淀率的影响

由图10可知，随着SSPS添加量的增加，灭菌型乳酸菌饮料的黏度逐渐增加，变化范围是：1.82～2.20，可见变化不大，主要是因为SSPS分子结构近似球形，水溶液的黏度较低，且不受盐类物质影响，且具有良好的热稳定性，适用于制备较低黏度的灭菌型乳酸菌饮料；SSPS中的中性多糖侧链是其主要的稳定作用，可以通过静电作用吸附酪蛋白，这样就能产生空间阻力，是蛋白质不能聚集而沉淀下来，即使在极低的pH环境下也可以使饮料保持稳定[10]。

（3）SSPS对饮料Lumi斜率的影响如图11所示。

图11 SSPS对饮料Lumi斜率的影响

由图11可知，在饮料中的蛋白质分子分离过程中的前2 000 s内，随着SSPS添加量的增加，透光率变化率逐渐减小，沉淀与悬浮分离速度逐渐减慢，Lumi斜率逐渐小；2 000 s以后，5个试验的Lumi斜率基本不变，可能是在该阶段酪蛋白已经完全沉淀，随着SSPS的继续添加，饮料稳定性基本无变化。

（4）SSPS对饮料粒径的影响

SSPS对饮料粒径的影响如图12所示。粒径分布的结果分析见表5。

图12 SSPS对饮料粒径分布的影响

表5 粒径分布的结果分析

由图12和表5可知，随着SSPS添加量的增加，粒径分布变化不大，可见SSPS对灭菌型乳酸菌饮料的粒径分布没有影响。

2.2 响应面试验结果分析

在单因素试验的基础上，以Pectin888、PGA、SSPS的添加量为自变量，Lumi试验的斜率和黏度为响应值，做3因素3水平的响应面分析试验，做3次平行。表6为试验结果。

表6 响应面试验结果

2.2.1 稳定剂对饮料Lumi斜率的影响

使用Design-Exper8.0.5.0处理数据，得到稳定剂对灭菌型乳酸菌饮料Lumi斜率的影响的回归方程：Y1=0.26-0.069A-0.071B+7.050E-003C+0.098AB+3.425E-003AC+0.030BC+0.065A2+0.029B2-0.013C2。由表7可知，该模型F值为23.01，说明该试验的拟合较好；P＜0.01，表示该模型具有极显著性，可以进行响应值的预测。校正后修复系数R2Adj=0.9253，说明有92.53%的响应值变化可以被模型解释，相关系数R2=0.9673，说明Lumi试验斜率与预测值非常接近，拟合程度较高，可以用来分析预测灭菌型乳酸菌饮料的稳定性。从表7中还可以看到，A项、B项均、AB项达到极显著水平，各稳定剂对Lumi斜率的影响程度为：A＞B＞C，即Pectin888＞PGA＞SSPS。

图13 Pectin888、PGA、SSPS对饮料Lumi斜率的影响

由图13中（a）可知，当PGA为固定值，随着Pectin888的增加，Lumi斜率逐渐减小；当Pectin888为固定值，随着PGA的增加，Lumi斜率先减小后增大，可见Pectin888与PGA添加量过低或过高都会使饮料的稳定性降低，Pectin888与PGA的交互作用显著。由图13中（b）和（c）可知，Pectin888与SSPS的交互作用、PGA

表7 Lumi斜率回归模型及方差分析

与SSPS的交互作用对Lumi斜率的影响都比较弱，说明Pectin888和SSPS、PGA和SSPS稳定剂复合对饮料的稳定性没有太大的影响。由回归模型得出响应面试验的最优条件为：Pectin888添加量为0.20%，PGA添加量为0.15%，SSPS添加量为0.17%时，Lumi斜率最小，为0.1853。

2.2.2 稳定剂对黏度的影响

使用Design-Exper8.0.5.0处理数据，得出稳定剂对灭菌型乳酸菌饮料黏度影响的回归方程：Y2=10.20+1.69A+2.33B+0.46C+1.25AB+0.63AC+0.40BC-0.088A2+0.91B2-0.088C2。P＜0.01，表示该模型极显著，可以进行响应值的预测。校正后修复系数R2Adj=0.9442，说明有94.42%的响应值变化可以被模型解释，相关系数R2=0.9756，说明饮料的黏度与预测值非常接近，拟合程度较高，可以用来分析预测灭菌型乳酸菌饮料的稳定性及黏度大小。从表8中还可以看到，A项、B

表8 方差及回归系数分析表

项、AB项、B2项均达到极显著水平，可以看出各因素对黏度的影响程度为：B＞A＞C，即PGA＞Pectin888＞SSPS。

由图14中（a）可知，当Pectin888为固定值时，随着PGA增加，黏度逐渐增大；当PGA为固定值时，随着Pectin888增加，黏度逐渐增大，可见Pectin888与PGA的交互作用显著。由图14中（b）和（c）可知，Pectin888与SSPS的交互作用、PGA与SSPS的交互作用对饮料黏度的影响都比较弱，说明Pectin888和SSPS、PGA和SSPS稳定剂复合对饮料的稳定性没有太大的影响。由回归模型得出响应面试验的最佳提取条件为：Pectin888添加量为0.25%，PGA添加量为0.15%，SSPS添加量为0.25%时，黏度最高为18.04×10-3Pa·s。

2.2.3 最终优化参数的确定及验证

图14 Pectin888、PGA、SSPS对饮料黏度的影响

表9 使用Design Expert8.0.5.0设置RSM优化中的自变量和相应函数

该试验主要是让3种稳定剂进行复配，使灭菌型乳酸菌饮料的Lumi斜率最小的同时使饮料的黏度最佳。由上述响应面分析可知，Lumi斜率最小与黏度适宜的工艺条件并不一样，因此使用Design-Exper8.0.5.0的数据优化程序，通过组合得到的数据，最终确定出最佳的条件。对参数进行以下的设定，见表9。

根据响应面模型及表9的设定条件可以得到最优的方案为：Pectin888为0.25%、PGA为0.15%、SSPS为0.19%时，预测的灭菌型乳酸菌饮料的Lumi斜率为0.2985，黏度为16.03×10-3Pa·s。对该条件进行验证，得到灭菌型乳酸菌饮料的Lumi斜率为0.2985±0.002，黏度为(16.04±0.13)×10-3Pa·s，与回归方程的预测值基本一致，验证了试验的合理性。

3 结 论

本文研究了Pectin88、PGA、SSPS 3种稳定剂单独使用和复合使用对灭菌型乳酸菌饮料稳定性的影响。当Pectin88添加量为0.5%时p H值最小，黏度相对较大，离心沉淀率、Lumi斜率、粒径分布相对达到最小值；PGA添加量在0.2%时，稳定性相对较好；SSPS添加量对Lumi斜率和粒径基本没有影响，随着添加量的增加离心沉淀率逐渐减小，说明饮料的稳定性增加。使用响应面的复配优化结果为：Pectin888为0.25%、PGA为0.15%、SSPS为0.19%时，灭菌型乳酸菌饮料的Lumi斜率为0.2985±0.002，黏度为(16.04±0.13)×10-3Pa·s。该试验为研究灭菌型乳酸菌饮料提供了一些理论依据。