全基因组测序技术在细菌耐药性检测中的研究进展

谷美，刘慧敏，孟璐，董蕾，邢萌茹，兰图，王加启，赵善仓，郑楠

（1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室，北京100193；2.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安271018 3.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，济南250100）

0 引 言

早在20世纪40年代，细菌的耐药性问题就已经出现。近几年，全球耐药性问题迅速加剧，耐药基因的传播和多重耐药菌株的不断出现，严重威胁人类公共卫生安全。常用的耐药性研究方法主要从表型和基因型两方面进行。表型的检测方法主要有K-B纸片法等药敏实验方法，基因型的检测方法主要有PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应，简称PCR）,qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,实时荧光定量核酸扩增检测系统,简称qP-CR)和全基因组测序等。近几年全基因组测序技术在检测细菌耐药性方面发展迅速，并得到广泛应用。Köser等[1]利用全基因组测序技术发现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，识别致病菌传输路径，有效控制MRSA的传播。本文将全基因组测序技术在细菌耐药性中的最新研究进展进行综述，对全基因组测序技术在细菌耐药性方面的应用具有重要意义。

1 全基因组测序技术的原理

全基因组测序技术主要依赖于第二代和第三代测序技术的结合，测序技术在第二代测序技术的基础上又有了新的发展[2]。其中测序成本、读长和通量是评估测序技术是否先进的重要指标。测序技术以测序平台为依托，测序平台竞争的重点之一就是测序产生的读长长度。第三代测序技术包括PacBio公司开发的Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术和SMRT技术[3]。下面主要介绍第三代测序技术中的PacBio公司的SMRT技术的测序原理。

PacBio SMRT技术采用了边合成边测序的思想[4]。其测序原理是：用DNA聚合酶与模板结合，用4色荧光标记dNTP，即A,C,G,T这4种碱基，其中DNA聚合酶的活性是影响读长的关键因素之一，激光是影响酶活性的主要因素之一。利用ZMW（零模波导孔）原理将反应信号与在碱基的配对阶段不同碱基加入时产生强大的荧光背景区别出来。ZMW(零模波导孔)的外径比检测激光波长小，激光通过ZMW的底部打上去后不会穿透小孔进入上方的溶液区，能量会被限制在需要检测的小范围里，使得信号只是来自于这个小反应区域，多余的碱基不会被检测到，从而达到降低背景噪音的目的[2]。SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，测序过程中容易出现随机错误，其测序错误率较高，达到15%。第三代测序技术在继续保持第二代测序技术高通量、低成本的优点的同时，有效解决了第二代测序技术存在的缺陷，其单分子测序和不需要PCR扩增的特点有效避免了因PCR扩增产生的偏向性而导致的系统错误，并且提高了读长[2]。

全基因组测序的技术路线主要包括：首先提取样品中的基因组DNA，随机打断之后，通过电泳回收目标DNA片段，然后制备目标DNA片段的基因簇cluster或电子扩增E-PCR目标DNA片段，并利用Mate-Pair或者Paired-End方法进行测序，并组装成Contig，并利用Paired-End的距离进一步组装成Scaffold或染色体等，测序深度、覆盖度和测序质量等是影响组装效果的主要因素[5]。

在全基因组测序中，测序深度是评价测序质量的指标之一。测序深度（Sequencing Depth）是指测序得到的碱基总量（bp）与基因组大小（Genome）的比值[5]。测序深度与基因组覆盖度之间存在正相关关系，测序深度越高，测序产生的错误率或出现假阳性结果的可能性越低。当测序样品可能包含同一物种的多种菌株时，需要更大的测序深度来识别少数变异体或分离菌株[6]。在全基因组测序的过程中，尽管整个基因组被测序，但是如果基因组包含重复的DNA片段，并且这个DNA片段比通过测序技术获得的DNA长度长，这个基因组就不能被完整的组装[7]。

2 全基因组测序技术的发展现状

20世纪70年代中期，Sanger的双脱氧链终止法和Maxam链降解为各种DNA测序技术发展奠定了基础，也标志着第一代DNA测序技术的出现。第一代测序技术测序读长能够达到1 000 bp，精确度高，其测序准确率高达99.999%，具有易掌握的特点，其缺点是操作过程复杂，耗时长，通量低，费用高，严重限制其广泛大规模的应用。

20世纪90年代以来，随着现代计算机技术和生物技术的发展，以高通量测序为特点的第二代测序技术出现。二代测序技术主要是包括Roche、Illumina和ABI三个公司主导分别推出的454技术、Solexa/Hiseq技术和Solid技术。第二代测序技术大大地降低了测序成本，提高了测序速度，准确度高，能够一次对一个物种的基因组或转录组的几百万条DNA分子进行测序，但其测序读长比第一代测序技术要短，大约是100～150 bp。

2011年以来，PacBio公司推出的SMRT和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔单分子测序技术标志着第三代测序技术的出现[3]。第三代测序技术的最大的特点是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，其缺点是测序成本高，测序错误率高，并且错误率的出现是随机的[8]。

2012年，Adam Phillippy等人结合第二代和第三代测序技术开发了长读取技术。Peters等[9]研究发现只有600个错误碱基存在于人类完整的基因组中，该项研究中人类完整的基因组序列通过利用长片段读取技术(LFR)中“条形码”DNA拼接完成，该技术不仅降低了测试过程中DNA的样本量，也大大地提高了全基因组测序的精度。

3 全基因组测序在细菌耐药性中的应用

细菌产生耐药性的遗传基础是基因突变或获得耐药基因，其表达后对相对应的药物产生耐药。针对性的检测细菌的耐药基因或基因突变是开展细菌耐药性分析研究的重要基础和方式。全基因组测序作为一种新型测序技术，能够分析确定已知耐药基因型及其突变情况，预测未知的潜在的耐药机制和耐药表型，是一种简单、高效和快速的耐药性分析方法[10]。

3.1 全基因组测序在革兰氏阴性菌耐药性分析中的应用

Gomi等[11]用全基因组测序成功表征了来自河水的大肠杆菌菌株，并在分离株中检测出了50多种抗性因子，证明了属于临床重要克隆群体的大肠杆菌菌株会导致地表水污染，并建议需要对地表水中的耐药性致病菌开展进一步的调查研究。Shridhar等[12]用全基因组测序分析了从牛粪便中分离出来的大肠杆菌O104菌株的不同血清型，对深入研究其遗传多样性和致病潜力具有重要意义。

McDermott等[13]利用全基因组测序分析了人体临床病例和零售肉中的非伤寒沙门氏菌的耐药基因，并检出氨基糖苷类、四环素类、β-内酰胺类、喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类和甲氧苄氨嘧啶类抗生素的耐药基因，为指导非伤寒沙门氏菌抗生素的使用具有重要意义。Li等[14]用全基因组测序分析了从中国南部沿海地区的人类粪便和粪便污染的食品样品中分离出来的44株韦太夫雷登沙门氏菌（Salmonella weltevreden）菌株，并分析了他们的系统发育关系，研究数据表明从中国南部沿海的人的粪便和食品样品中分离的S.weltevreden菌株与东南亚地区的菌株之间存在系统发育的相关性，这也表明了不同国家和地区之间的细菌可以通过食物进行潜在的内在转移。Kagambèga等[15]利用全基因组测序对病人和家禽粪便中多重耐药的鼠伤寒沙门氏菌进行比较和表征，研究数据表明，所测菌株对氨苄西林、氯霉素、链霉素、磺胺甲氧苄啶4种抗生素具有耐药性，并检出其耐药基因，对理解鼠伤寒沙门氏菌的基因型和潜在宿主之间的地理传播具有重要意义。

Rupa Iyer等[16]利用全基因组测序对从美国德克萨斯州圣哈辛托河的沉积物中分离出来的产气克雷伯氏菌PX 01进行测序，发现了其基因组序列草图，其编码在97个重叠群中共计5 262 952 bp。Palmieri等[17]利用全基因组测序阐述了头霉素和β-内酰胺类抗生素的耐药机理。

3.2 全基因组测序在革兰氏阳性菌耐药性分析中的应用

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性菌的代表。Gordon等[18]研究表明全基因组测序对金黄色葡萄球菌耐药基因型预测的总体灵敏性和特异性是97%和99%，这表明全基因组测序在金黄色葡萄球菌和其他主要细菌病原体的耐药性预测方面具有广阔发展前景。

Zhang等[19]利用全基因组测序分析了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ATCC14917）对链霉素的耐药

机制，研究证实，L.plantarum ATCC14917中的移动因子不存在耐药基因，即结合转座子等可动遗传因子中不存在与链霉素耐药相关的突变基因。本研究通过生物信息学和全基因组测序结合的方法，对L.plantarum ATCC14917的耐药基因进行研究，并初步评价了链霉素抗药性益生菌与抗生素链霉素联合应用的安全性，对有效评价潜在耐药基因及其迁移率具有重要意义。Metcalf等[20]利用全基因组测序检测无乳链球菌的抗生素抗性机理，研究结果表明，以全基因组测序为基础的耐药性检测比常规传统的药敏试验更有效，特别是在大规模和长期菌株监测方面，全基因组测序技术比常规测试方法更实用，为促进全基因组测序在革兰氏阳性菌耐药性方面的应用具有重要作用。

微杆菌属是以产抗生素为特征的革兰氏阳性菌，能够在陆地和水生环境中生长。最近研究发现，微杆菌也成为一种罕见的机会性人类病原体。Iyer等[21]通过利用全基因组测序对从美国德克萨斯州的圣哈辛托河中的沉积物中分离出来的微杆菌进行分析，得出了232个微杆菌株AISO3在支架水平上组装的3 696 310 bp的基因组序列草图(染色体和质粒)，为进一步研究微杆菌耐药性及其耐药基因的转移奠定基础。

Phelan[22]等用全基因组测序检测了抗结核病药物的耐药性，该研究比较了两种测序平台的重现性，证实了某些基因组区域的平台特异性可能会影响对特定药物的耐药性预测，这些发现可能会影响临床实践，对以后改善治疗结核病的药物使用具有指导作用。

4 细菌耐药性其他检测方法

4.1 K-B法

药敏试验是检测细菌耐药性的常规方法，药敏试验具有国际化的操作流程，且敏感性高，其中K-B纸片法（Kirby-Bauer纸片法，K-B法）是最常用也是最经典的药敏定性检测方法，它能够在抑菌浓度范围内抑制待测菌的生长，形成透明的抑菌圈，根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感度[23]。K-B纸片法具有可重复性好、操作简便、灵活性高，结果判读直观容易，成本低等优点，并且易于向实验条件较差的边远地区普及，但是不能获得相对精确的药物最低抑菌浓度(minimuminhibitory concentration，MIC)，并且易受人为因素的影响，影响结果准确性[24]。

Gautam等[25]研究表明K-B纸片法可以可靠地用于检测鲍曼不动杆菌复合菌株中碳青霉烯类药物的耐药性。Joseph等[26]研究表明K-B纸片法可以可靠地用于检测非发酵革兰氏阴性杆菌的美罗培南耐药性。Karami A等[27]研究证实纸片扩散法具有较低的灵敏性和特异性。Qin等[28]用K-B纸片扩散法检测出95株临床菌株中有76%的菌株对第三代头孢菌素具有诱导性耐药性，研究表明，K-B纸片扩散法是检测菌株耐药表型的重要方法。

4.2 微量肉汤稀释法

微量肉汤稀释法是细菌药物敏感性定量检测的经典方法。其基本原理是在含有一系列稀释浓度药物的肉汤或琼脂培养基上，接种菌株，并观察菌株的生长状况，获得相对精确的药物最低抑菌浓度MIC。微量肉汤稀释法以测定菌株的最小抑菌浓度的大小为依据来判断细菌对抗菌药物的敏感情况，最小抑菌浓度值越小，说明细菌对这种抗生素的敏感度越高。微量肉汤稀释法是一种操作简便、成本低，既快速又准确细菌耐药性常规检测方法，对监测菌株药物敏感性的变迁、研究菌株耐药性的流行趋势具有重要意义[29]。

Karami等[30]比较了纸片扩散法和微量肉汤稀释法检测细菌耐药性结果的一致性，研究表明，后者在检测细菌耐药性方面具有较高的敏感性和特异性。Zhang等[31]研究表明，微量肉汤稀释法在对多重耐药肺结核菌株中的乙胺丁醇耐药表型检测中有较高的准确性和相关性。江培涛等[32]用微量肉汤稀释法监测金黄色葡萄球菌诱导型克林霉素耐药，结果显示金黄色葡萄球菌的诱导型克林霉素耐药发生率很高，对监控林可霉素类抗生素的使用，减少患者损失和耐药菌株的流行具有重要意义。

4.3 PCR方法

PCR方法是检测基因型的常用检测方法。PCR方法主要包括普通PCR和qPCR，其原理都是在目的基因特异片段基础上的扩增。最初PCR仅用于鉴定菌种和定量分析，但是随着近几年细菌耐药机制研究地不断深入，PCR也在细菌耐药基因的检测中得到广泛应用。与PCR相比，qPCR完成了定性到定量的飞跃，且耗时短，灵敏度高、特异性好，在操作过程中可有效避免样品之间的污染，实时监控实验过程、分析实验结果，PCR产物无需进行凝胶电泳分析，还能检测目标基因丰度，检测细菌生长状况，缩短细菌的培养时间，为细菌耐药性研究分析奠定基础[33]。

PCR技术在细菌耐药基因检测应用中具有稳定性和灵敏度高、重复性好、快速简便的优势。Ghoddusi等[34]用PCR技术对从家养鸡分离出来婴儿沙门氏菌（Salmonella Infantis）进行分子鉴定和耐药基因的检测，结果表明婴儿沙门氏菌的耐药表型和耐药基因型完全符合，并且对四环素类抗生素有较高的耐药率。因为家养鸡中的婴儿沙门氏菌对四环素类有较高的耐药率。Rebelo等[35]在PCR技术的基础上开发了一种复合PCR技术，该技术可以快速地检测目前肠杆菌科中所有的mcr基因，该研究表明来自西班牙、德国、法国和意大利的牛和猪的菌株结果与全基因组测序数据完全相符，这个方法能够快速确认mcr阳性细菌并克服粘菌素耐药表型检测的局限性。

Schmidt等[36]研究表明qPCR可以检测个体动物中抗生素的耐药水平，可以更准确地量化抗生素耐药基因。Clasen等[37]研究表明qPCR可以准确测定丹麦猪群中的erm B，erm F，tet(M)，tet(O)和tet(W)5种耐药基因。Sartori等[38]评估了qPCR检测牛奶样品中金黄色葡萄球菌基因型B（Staphylococcus aureus genotype B）的敏感性和特异性，研究表明qPCR检测S.aureus GTB具有较高的灵敏性，准确度高。

4.4 基因芯片法

基因芯片（genochip）技术是一种高通量自动化检测技术，主要是通过基因特异性扩增和准确的基因鉴别来达到细菌耐药性检测的目的[33]。Pang等[39]研究表明，在检测结核杆菌多重耐药性方面，基因芯片方法比常规药敏试验成本低、效率高、安全性高。近年来随着基因芯片技术在实验方法、信号采集、和样品分析等性能方面的极大提高和市场价格的降低，更有利于其在细菌耐药基因检测中的应用[40]。

Zhang等[41]利用基因芯片分析中国长春地区的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）的耐药性和基因突变，研究证实基因芯片检测结核分枝杆菌耐药性的结果准确可靠，此方法可以用来检测临床菌株中的耐药基因突变型，为未来结核分枝杆菌耐药性研究提供参考。Zhu等[42]研究表明基因芯片技术为结核分支杆菌耐药性的检测提供了一种简单快速、可靠、准确的临床检测方法，该技术有望成为结核分枝杆菌耐药性高度流行地区重要的诊断工具。

Low等[43]分别调研了城市具有不同土地利用类型的两个非点源集水区中抗生素耐药水平，利用基因芯片技术识别确认了城市集水区中的耐药基因组中的耐药细菌群体，揭示了两个集水区具有相似的抗生素耐药基因。研究结果表明，不同土地利用类型的两个集水区识别的耐药细菌和基因与抗生素抗性和生物合成有关，环境中的细菌是抗生素耐药基因的潜在携带者。这项研究是基因芯片研究城市水流域中的耐药基因的第一次应用，有利于开发基因芯片技术在细菌耐药性方面的应用，为进一步开展耐药基因的风险监测和风险评估提供依据。

4.5 LAMP技术

环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是由日本学者Notomi T于2000年发明的具有独特的核酸扩增机制的一种新型恒温核酸扩增技术，用琼脂糖凝胶电泳验证其扩增产物，会呈现出典型的阶梯状条带[44]。LAMP通过链置换扩增反应，将靶基因快速扩增，并针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在恒温条件下，在聚合酶的作用下进行核酸扩增，具有操作简单特异性强的特点[45]。

Le等[46]用环介导等温扩增PCR杂交-热酶联免疫吸附试验方法代替传统的PCR扩增方法来扩增少量的目标DNA，结合高分辨率的热熔工艺筛选在结核分枝杆菌M.tuberculosis的抗性突变体中的热点突变，研究表明该方法可以直接快速的从临床样本中检测出多重耐药M.tuberculosis菌株。这是检测抗性突变体高分辨率热熔炼方法的第一份研究报告，该研究使用PCR技术和ELISA读取器，可有效降低实验成本。Gong等[47]在LAMP基础上发展了一种复合LAMP方法，该方法能够快速，特异灵敏的检测三种已知的磺胺耐药基因（sul1，sul2，sul3），并快速筛查临床菌株中的磺胺耐药基因，对指导相关抗生素的使用具有重要意义，该方法将会成为研究细菌耐药基因发展演变机理的重要工具。Mu等[48]利用LAMP检测金黄色葡萄球菌S.aureus携带的耐药基因msr A，研究结果表明LAMP方法是检测耐药基因msr A的最佳方法，该方法简单快速，并具有较高的灵敏度和特异性，为临床控制含有msr A耐药基因的细菌病原体，有利于促进LAMP方法在细菌耐药性方面的应用。

综上所述，细菌耐药性检测方法在细菌耐药性方面的应用范围广，作用大，现将主要的细菌耐药性检测方法的优缺点概括如下（见表1）。

表1 主要的细菌耐药性检测方法优缺点比较

5 展 望

通过全基因组测序技术全面准确地分析基因组的碱基序列，破译基因组所包含的遗传机制等所有信息，揭示基因组的复杂性和多样性，对提高各种细菌发生、发展的认知具有重要意义，也为细菌耐药性分析奠定了基础[55]。全基因组测序可以快速识别细菌耐药性机理，可以用来研究不同条件下的细菌耐药性的发展演变，测量耐药性出现速率，检测临床抗生素耐药性。随着测序技术的发展，全基因组测序已经成为细菌耐药性研究的重要工具[6]。