巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长动力学模型的研究

魏钊异，方婷，李长城，彭亚博，李晓婷，潘洁茹，叶海梅，林侃

（1.福建农林大学食品科学学院,福州350001；2.福州市疾病控制预防中心，福州350004）

0 引 言

单核细胞增生李斯特菌（Listeria m onocytogenes，LM）是一种常见的能引起人畜共患病的革兰氏阳性短杆菌，可使人患脑膜炎、败血症、流产早产等疾病，危害严重。与其他食源性致病菌相比，由LM引发的李斯特菌病爆发几率相对较低，但其致死率却高达20%～30%[1]。世界卫生组织（W orld Health O rganization,W HO）指出，包括蔬菜、奶及奶制品、肉制品在内的消费性食品，都受到不同程度的污染[2]，特别是在乳制品中普遍存在[3]。

巴氏杀菌奶采用低温杀菌技术，能最大限度保证牛奶的营养成分不致流失，所以越来越受到消费者的喜好,占液态奶销量的50%左右[4]。LM在低温（0～4℃）下仍能生长，是一种典型的耐冷细菌。并已有报道显示，LM能够耐受巴氏消毒，对生鲜乳、巴氏杀菌乳等相关乳制品造成食用风险[5]。2007年11月，美国马萨诸塞洲发生了一起由当地牛奶场生产的巴氏消毒乳引起的单增感染的暴发，造成5人感染，3人死亡[6]。

预测微生物学是以计算机为基础，描述特定环境下微生物的生长、存活和死亡的情况，建立数学模型，从而为风险评估提供基础。国内外已有较多关于食品中单增李斯特菌的预测模型的研究。Li[7]研究5～30℃盐渍与未盐渍的三文鱼鱼籽中单增李斯特菌的生长动力学，结果表明，利用Ratkowsky平方根模型拟合得到的三文鱼鱼籽样品中单增李斯特菌理论上的最低生长温度为-0.5℃，与FDA报道的水产品中单增李斯特菌最低生长温度（-0.4℃）非常接近。Fang[8]等人研究鲜切哈密瓜中单核增生李斯特菌和背景微生物的生长动力学，得出Arrhenius-type模型提供更准确的估计单增李斯特菌在温度(＜4℃)条件下的生长速率。邹宇[9]等研究5、12、25、35℃牛奶中单增李斯特菌的预测模型，确定Gompertz方程为其在牛奶中的最优初级模型，并采用Belehradek方程描述温度对其最大生长速率和延迟时间的影响。

目前，尚未见有关巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长及其预测微生物学方面的报道。因此，本文拟用巴氏杀菌奶为原料，主要目的是通过初级模型和二级模型来描述单增李斯特菌在4～43℃范围内（4、8、12、16、20、25、30、37、40℃和43℃）的生长，并建立描述其生长规律的数学模型，以期为相关食品监管部门开展巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的风险评估提供科学基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

巴氏杀菌奶：市售，袋装，产品标注的保质期为0～4℃下5 d。

单增李斯特菌菌株（CICC21632、CICC21633、CICC21635、CICC21639）购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、PALCAM琼脂、脑-心浸出液肉汤（BHI）、蛋白胨粉：广东环凯微生物科技有限公司；利福平：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AIRTECH生物安全柜：苏州安泰空气技术有限公司；H-1850R高速冷冻离机：湖南相仪实验室仪器有限公司；SHP-250细菌生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；KB115低温恒温箱：德国BINDER公司；VORTEX-5漩涡混合器：上海习仁科学仪器有限公司；DX-200高压灭菌器：德国Systec公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌培养及接种菌液的制备

参照Fang[8]的方法，活化、培养及制备单增李斯特菌混合接种母液，并通过梯度稀释，使单增李斯特菌浓度达5.5 log CFU/mL，备用。

1.3.2 巴氏杀菌奶样品的准备与接种

以无菌操作，将巴氏杀菌奶分装到无菌试管中，每管10 mL，备用。将100μL单增李斯特菌混合菌液接种到每个无菌试管中，并充分震荡均匀放入一定温度的培养箱中培养。

1.3.3 生长试验与计数

将已接种的样品分别放置于4，8，12，16，20，25，30、37、40和43℃的恒温培养箱中培养，按照预设的时间间隔取样，测定单增李斯特菌菌落数，其中每个温度条件设置10～14个取样点。用PW梯度稀释每个样品，参照Fang[8]的方法采样计数。

1.3.4 初级模型

分别采用Baranyi模型[10]和Huang模型[11]拟合各个温度对应的单增李斯特菌生长数据，其中Baranyi模型的表达式如式（1）和（2）所示，Huang模型的表达式如式（3）和（4）所示。

Y0，Ymax为初始菌浓度和稳定期菌浓度/(ln CFU/g)；

μmax为比生长速率/(h-1)；

t为时间/h；

λ为迟滞期；

h0为反应细菌所处的生理状态，且h0=λμ；

α为常数(=4)，定义细菌生长时由迟滞后期向对数期转化。

1.3.5 二级模型

分别采用Ratkowsky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]，评价温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率的影响，3种二级模型的表达式分别为式（5）～（7）。

式中：T0为最低生长温度/(℃);

T为细菌所处的环境温度/(℃)；

μmax为比生长速率/(h-1)；

Topt为最适生长温度/(℃)；

μopt为最适温度下的最适生长速率/(h-1)；

a、b为常数。

1.3.6 数据拟合与分析

本研究采用预测微生物学专用软件IPM P 2013[15]对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长数据进行拟合处理。采用方差分析（ANOVA）分析比较各个模型参数之间的差异，由此选择最优模型。

1.3.7 验证试验

采用预测微生物学专用软件IPM P拟合得到各个模型的最低生长温度，做恒温验证试验。将巴氏杀菌奶中接种单增李斯特菌后，放置在得到的最低生长温度恒温培养4天后，取样、计数。

2 结果与分析

2.1 巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长特点

在各恒定温度生长试验中，单增李斯特菌的初始接种量为5.0-5.5 log CFU/g，单增李斯特菌的生长曲线均表现出迟滞期、对数期和稳定期3个阶段。在试验温度（4～43℃）范围内，其生长速率呈现出先增大后降低的变化。在低温（4～8℃），其生长速率较低；当温度达到37℃，其生长速率达到最大；当温度达到40℃后，其生长速率又开始降低。

图1 巴氏杀菌奶中单增李斯特菌（LM）在不同温度下（4～43℃）的生长曲线

2.2 初级模型比较分析

将各恒定试验温度下单增李斯特菌所获得的生长数据都可以用Huang模型和Baranyi模型来拟合，所得到的拟合曲线如图1所示。除了对迟滞期和对数期向稳定期的转折点的描述有差异外，2种模型均能较好地拟合巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长情况。统计参数RM SE、RSE、AIC值是衡量模型拟合精确度的重要指标，一般来说，其数值越小，模型拟合的精确度越高。表1列出了2种初级模型的RM SE、RSE、AIC值，两种模型的RM SE、RSE、AIC值在同一统计量取值较为接近，无显著差异，可以认为2种模型对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长曲线均具有良好的拟合精度。

表1 巴氏杀菌奶中单增李斯特菌2种初级模型相关参数

在4～43℃时，Huang模型中，单增李斯特菌的μmax随着温度的增加，由0.017增加到1.024达到最大，当到40℃后开始降低为0.743，43℃为0.498。Baranyi模型中，单增李斯特菌的μmax随着温度的增加，由0.017增加到1.005达到最大，当到40℃后开始降低为0.721，43℃为0.512。比较拟合得到的H uang模型和Baranyi模型估算得到的单增李斯特菌生长速率之间的关系，回归直线的斜率为0.9994（如图2所示），R2＞0.99，表明由这两种模型估算出的单增李斯特菌生长速率无显著差异，进一步验证了2种初级模型对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长具有同等拟合效果。

图2 Huang模型和Baranyi模型比生长速率之间的比较

由单增李斯特菌的生长特性可以知道，其耐低温，在4℃的环境下仍然可以生长。刘珊娜[16]等人研究冷藏牛奶中单增李斯特菌的生长情况，发现即使是在冷藏条件下，单增李斯特菌达到稳定期的菌数有2 lg CFU/m L的增长。分析其原因是牛奶不但营养丰富，水分含量高，且pH接近中性，从而有利于微生物的生长繁殖；邹宇[9]等也研究了单核细胞增生李斯特菌在牛奶中的生长预测模型，结果也证实该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，且在5、15、25和35℃4种不同温度下的最大比生长速率分别是0.050、0.170、0.350和0.600。综上发现，冷藏食品LM污染的风险很高，而牛奶也给其繁殖提供了有利条件。巴氏杀菌奶须低温储藏，在本试验中，将其放置4℃进行恒温实验，其生长速率为0.017，达到稳定期后单增李斯特菌的菌数也有1 lg CFU/m L的增长。

2.3 二级模型比较分析

图3 3种二级模型描述温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率影响的拟合曲线

通过初级模型（H uang模型和Baranyi模型）拟合得到巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长速率无显著性差异，所以可以将两组生长速率的数据进行合并，建立温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率影响的二级模型。图3是表明3种二级模型（R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型、Cardinal模型）均可以用于描述温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率的影响。表2列出了Ratkow sky平方根模型、H uang模型、Cardinal模型模拟单增李斯特菌在巴氏杀菌奶中二级生长模型的相关参数。

表2 巴氏杀菌奶中单增李斯特菌2种二级模型相关参数

由表2可知，由R atkow sky平方根模型、Huang平方根模型和Cardinal模型拟合得到的巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的最低生长温度和最高生长温度分别为：0.218、2.733、2.99和46.389、45.755、44.692℃，3种预测模型拟合出来的最高生长温度很接近。根据国际微生物标准委员会（ICSM F）的报道，单增李斯特菌的最低、最适、最高生长温度分别为-0.4，37℃和45℃[17]。Ratkow sky平方根模型推导出的单增李斯特菌的理论最低生长温度为0.218℃，与ICSM F的报道更为接近，但最高生长温度比报道的要高；Huang平方根模型和Cardinal模型预测的最低生长温度分别为2.733℃和2.99℃，都高于了ICSM F报道的最低生长温度；Huang平方根模型最高生长温度为45.755℃，略高于报道的温度，而Cardinal模型的最高生长温度为44.692，比报道的温度要略低。由此结果开展了验证实验，将接种单增李斯特菌的巴氏杀菌奶放置0.2℃恒温培养4天后取样、计数，发现巴氏杀菌奶中单增李斯特菌增长了约0.4 Log，由此可知，Ratkow sk平方根模型更适合描述温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率的影响。

3 结 论

本文研究在4～43℃恒定温度条件下，巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长动力学模型，发现接种的单增李斯特菌在巴氏杀菌奶，放在低温（4℃）条件下仍能生长，并发展成为完整的生长曲线，所有的曲线都包含有滞后期，指数期和稳定期。使用Huang模型和Baranyi模型作为初级模型，对各个恒定温度得到的生长数据进行拟合，综合分析比较RM SE、RSE、AIC值和生长速率，结果表明两种初级模型无显著差异，均适合用于描述巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的生长状况。

使用R atkow sky平方根模型[12]、Huang平方根模型[13]和Cardinal模型[14]作为二级模型，分析温度对于单增李斯特菌生长速率的影响。结果表明，三种模型都可以描述温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率的影响。R atkow sky平方根模型推导出的单增李斯特菌理论最低生长温度为0.218℃，与食品中的最低生长温度相符。因此，Ratkow sky平方根模型更适合描述温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长速率的影响。本文研究了温度对巴氏杀菌奶中单增李斯特菌生长动力学的影响，并测算了数学模型在预测微生物生长速率方面的应用。研究所建立的模型可为相关食品监管部门开展巴氏杀菌奶中单增李斯特菌的安全风险评估提供科学基础。