奶牛代谢紊乱与褪黑素应用研究进展

文/姚昱君 郭江鹏 张 鲁 路永强 刘国世＊

（1 中国农业大学动物科学技术学院；2 北京市畜牧总站）

75%的疾病发生在奶牛产后第1个月，尤其是营养代谢类疾病，是指机体代谢功能紊乱形成的疾病。产前3 周到产后2 周左右是奶牛围产期，围产期奶牛体内新陈代谢发生巨大的变化，这一时期发生代谢紊乱严重阻碍奶牛的生长发育，损害生产性能，易形成奶牛繁殖障碍，如继发性不孕症[1]影响生殖周期。

1 奶牛代谢紊乱的发病原因

奶牛产后真胃变位，前胃迟缓，机体炎症造成奶牛食欲下降，采食量低，导致机体营养供应不足。高产奶牛泌乳、妊娠和分娩期间营养需要增加，即便是提高奶牛产后饲料营养、改良饲料适口性增加奶牛采食，奶牛摄入的养分依然无法平衡机体能量损失。机体只能通过调节代谢，动员不同组织能量储备，形成奶牛负能量平衡状态（Negative Energy Balance，NEB），NEB是代谢疾病的病理学基础。产后奶牛摄食量不足[2]，饲料能量物质过高，碳水化合物和干物质比例过低、饲养员技术经验不足，都会导致NEB形成，进而导致代谢紊乱。奶牛摄食量低、食欲不振，既是代谢紊乱的症状，也是产生的原因。

1.1 酮病的发生原因

1894年，Lande首次提出奶牛酮病的概念[1]，奶牛酮病又被称为奶牛醋酮血症，其特征是血液、尿液和牛奶中酮水平升高，血糖降低。奶牛酮病有多种类型，分为原发性、继发性、营养型和自发型。

在N E B期间，奶牛通过分解脂肪和蛋白平衡机体的能量需求，脂肪分解产生甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）使血液中游离脂肪酸（Freefattyacid，FFA）浓度增加，FFA通过肝细胞β-氧化作用释放能量生成酮体[3]。同时奶牛体内激素水平受代谢紊乱影响，血糖浓度下降，胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增多。垂体葡萄糖受体激活，促进肾上腺素的分泌。β-氧化作用受到胰高血糖素刺激和胰岛素抑制。三种激素共同作用，使酮体生成增多，从而形成酮病。

1.2 脂肪肝的发生原因

脂质超过肝脏自身氧化和分泌的能力，在肝脏积累形成脂肪肝，泌乳早期超过50%的奶牛会出现甘油三脂（Triacylglycerol，TAG）积累，30%～40%的奶牛患有中度脂肪肝，5%～10%的奶牛患有重度脂肪肝[4]。

健康情况下，TAG被肝脏水解，或者通过将TAG转化为极低密度脂蛋白（Very Low Density Lipoprotein，VLDL）的形式排出肝脏，VLDL是转运TAG的主要方式。患脂肪肝的奶牛，机体将肝脏无法代谢分泌排出体外的多余脂质，以TAG的形式贮存在肝脏中，脂质积累导致肝脏代谢能力下降。脂肪肝奶牛体内VLDL合成减少，TAG无法及时排出肝脏，在肝脏内形成脂质积累。反刍动物与非反刍动物相比，脂肪肝发病率更高，可能与VLDL合成速度低有关。

脂肪肝患病早期，奶牛会出现食欲不振，体重减轻，产奶量下降，尿酮浓度升高等症状，严重时肝肾衰竭或心脏骤停。脂肪肝经常伴随其他肝脏疾病发生，与机体各组织器官密切相关。研究发现，脂肪肝导致高产奶牛后续受孕率降低，机体出现炎症和溃疡，分娩间隔时间延长，显著影响生殖性能，严重时导致心肌炎，肾脏、卵巢、子宫和肌肉组织的坏死。

1.3 酮病与脂肪肝的关联

酮病和脂肪肝的发生都与代谢紊乱形成的NEB有关[5]。代谢紊乱导致机体生成高浓度的非酯化脂肪酸（NEFAs）和β-羟基丁酸（β-hydroxybutyrate，BHBA），增大肝脏负担，导致肝脏脂质积累，肝脏是机体代谢的重要场所，肝脏疾病影响糖异生过程，继而诱发酮病和脂肪肝，酮病产生的NEFA损伤肝脏，脂肪肝被认为是酮病的征兆[6]，二者相互作用。与健康奶牛相比，患有代谢疾病的奶牛共发现524 个肝脏基因表达差异显着，其中10%与新陈代谢有关，脂质代谢和糖异生的关键基因显著上调[4]。两种疾病通过不同的机制，损伤奶牛肝脏，对器官组织产生不可逆的损伤。

2 代谢紊乱损伤雌性动物生殖机能

随着动物营养科学及遗传育种研究快速发展，奶牛产奶量及奶品质大幅度提高。其繁殖性能在近五十年中并未随着科技的进步而增加，甚至还有所下降。近期研究表明，高产奶牛代谢紊乱疾病是奶牛繁殖性能降低的主要原因之一[7]。

发生酮病或脂肪肝的奶牛，血液中NEFA、BHBA、乙酰乙酸（Acetoxyacetic Acid，AcAc）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GTP）等物质的浓度会随着机体代谢的变化而升高[8]。酮病奶牛血液中NEFA浓度超过1. 0 mmol /L，被用作检测代谢类疾病的指标。NEFA本身具有脂毒性，产生ROS引发氧化应激，损伤机体[9]，同时影响内质网压力发生变化，增加机体内细胞凋亡[10]。NEFA或其相应的酰基辅酶A能够通过结合特定受体直接改变信号传导途径，或改变蛋白质结构和功能，间接改变信号传导途径。NEFA激活TLR-4和MAPK途径，启动NF-κB信号传导途径，增大细胞炎症反应[3]。肝病奶牛体内的卵母细胞质量和发育潜力显著低于健康奶牛[11]，高浓度的BHBA和葡萄糖损伤卵母细胞成熟和胚胎发育潜力[12]，高浓度的BHBA和γ-GTP抑制牛卵母细胞MII期发育[13]。

代谢紊乱引起激素分泌发生变化。NEB动员脂肪分解，直接抑制促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌，同时影响促卵泡素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌激素（E2）、孕酮（P4）、瘦素（Leptin）等分泌[14]。卵巢排卵过程受到抑制，优势卵泡无法及时排出，形成卵泡囊肿，引起卵巢发生病变。酮病奶牛体内胰岛素含量较低，胰岛素具有刺激牛卵泡细胞发育的功能[15]，肝病奶牛卵泡液中生长因子浓度较低[16]，多种因素共同影响机体无法顺利发情，卵泡和输卵管中卵母细胞和早期胚胎发育受阻，最终不仅导致奶牛妊娠率减低，流产率升高[17]，而且可能出现子宫机能减退等现象。

肝脏脂质积累会增加机体对炎症刺激的敏感性，使奶牛患病率增加，容易形成肝炎。肝脏的变化导致GHR-1A（GH受体），IGF-I，IGFBP 3、4、5、6（多种IGF结合蛋白）和胰岛素样生长因子酸不稳定亚基（Insulin-like growth factor acid-labile subunit，IGFALS）的浓度降低，IGFBP-2增加，导致IGF-I的循环浓度和半衰期显著下降，卵泡成熟受阻，雌二醇的合成能力降低，排卵延迟。

代谢紊乱使免疫细胞受到过氧化反应损伤，免疫功能降低[18]。体内和体外的实验已经证实高浓度的NEFA损伤免疫细胞，免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）和外周血单核细胞γ-干扰素（IFN-γ）[19]受NEFA影响降低。BHBA增多，白细胞数量减少，免疫细胞功能随之下降[20]。机体免疫力低下，更易患感染性疾病，如乳房炎和子宫炎，炎症抑制胚胎发育，影响产犊后子宫修复[4]。

3 褪黑素与营养代谢疾病

褪黑素（MLT，n-乙酰-5-甲氧基色胺）是一种主要由松果体分泌的吲哚类激素。在哺乳动物中，色氨酸转化为5-羟色胺，AANAT将5-羟色胺转化为n-乙酰-5-羟色胺，经过HIOMT的催化，最终生成褪黑素。

光线和视觉影响交感神经支配褪黑素合成。光照强度变化刺激视网膜神经节细胞去极化，经视神经刺激下丘脑视交叉上核，下丘脑视交叉上核通过突触后神经节网释放肾上腺素，作用于松果体。松果体调节AANAT酶的表达和活性，调节褪黑素合成与分泌。脊椎动物血液中的褪黑素水平有明显的昼夜节律性，夜间水平较高，日间分泌较低[21]。

已知两种褪黑素受体为褪黑素膜受体（MMR）和褪黑素核受体（MNR），其中褪黑素膜受体分为MT1、MT2和MT3三种。MTl和MT2都是G蛋白耦联受体，广泛分布于神经系统、心血管系统、免疫系统和生殖系统[22]。MT3属于还原酶家族，存在哺乳动物各种组织和器官中[23]，与其他亲水性或亲脂性抗氧化剂相比，褪黑素的两亲性使它更容易穿过所有形态生理障碍，可以保护整个细胞免受氧化损伤[24]。褪黑素独特的生理特性使其在代谢紊乱的调节中发挥重要的作用。

3.1 褪黑素缓解代谢紊乱

褪黑素缓解代谢紊乱主要与褪黑素保护肝脏的功能有关。肝脏是人体主要代谢器官，作为机体的中转站，在糖、脂、蛋白质和氨基酸代谢中起重要作用。在妊娠和哺乳时期，机体需要大量的能量和营养，能量需求的变化使肝脏负担增加，此时肝脏易发生病变[25]。

褪黑素强大的抗氧化功能保护肝脏，直接清除自由基，包括O-，H2O2，OH，ROO，1O2，NO，ONOO-等多种自由基；激活抗氧化酶，提高抗氧化酶活性及基因表达[26]。增强其他抗氧化剂活性[27]，保护抗氧化酶免受氧化损伤[28]。谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽还原酶（GSH-Rd）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）[29，30]等活性和表达量都提高；减少有害物质产生，如丙二醛（M D A）和次氯酸（H y p o c h l o r o u s a c i d）减少[31]；抑制增加氧化应激酶的活性和相关基因的表达，如一氧化氮合酶（NOs）[32]、黄嘌呤氧化酶（XO）的活性和表达量降低，下调HO-1基因的表达。褪黑素具有降血脂的功能，促进胆固醇转化为胆汁酸，抑制胆固醇合成和受体的活性。体内的总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）减少，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）增多；褪黑素具有抗炎性，可以减少促炎细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子β（TGF-β）在体内含量减少，自然杀伤细胞（NK cell）增加；防止NLRP3炎性小体活化，硫氧还蛋白结合蛋白2（TXNIP）表达增加，中性粒细胞浸润减少。抑制氨基转移酶发挥作用，如丙氨酸转氨酶（ALT）和天门冬氨酸转氨酶（AST）活性降低；线粒体氧化磷酸化反应过程产生大量ROS，无法利用常规的抗氧化剂进行清除，褪黑素独特的双亲性保护细胞线粒体免受损伤，提高线粒体氧化磷酸化效率，减少线粒体电子漏，减少自由基生成[33]。褪黑素抑制固醇调节元件结合蛋白（SREBP-1c）活化，SREBP-1c靶基因下调，阻止脂多糖lps诱导的肝脏脂质堆积[34]。

此外，褪黑素可以抑制雌激素缺乏和内质网应激引起的肝脏脂肪变性。外源性褪黑素对去卵巢（OVX）大鼠肝脏脂质积累和细胞氧化应激均有抑制作用，褪黑素可减轻OVX大鼠肝脏脂肪变性和细胞氧化应激损伤[35]。microRNA（miRNA）是基因调控的关键调节因子，miRNA功能障碍是代谢疾病的共同特征，miR-23a调节ER应激。褪黑素缓解衣霉素诱导的脂质积累，通过控制miR-23a表达机制和Ca2+稳态，降低肝细胞的ER应激，在改善ER应激诱导的肝脂肪变性和炎症中起关键作用，可用作药理学试剂保护肝免受ER应激诱导的代谢功能障碍[36]。

3.2 褪黑素参与代谢节律性调节

机体代谢受到昼夜节律的调控，机体生物钟通过调节代谢关键步骤和反应底物，实现代谢途径的时间调节。目前已知的生物节律调节因子有去乙酰化酶（SIRT1）和单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）。两者与生物钟机制联合作用，参与哺乳动物生理代谢与生物节律调节。褪黑素连接光周期和机体内各种节律，参与调节机体节律性[37]，并且可以改善由于昼夜节律紊乱造成的能量代谢变化[38]。另外，褪黑素的昼夜节律性参与调节生殖活动，主要通过调节性腺轴改善机体生殖的功能，改善卵巢功能和卵泡发育，在后期继续影响胎儿发育[39]。

3.3 褪黑素增强机体的免疫功能

褪黑素作用于免疫细胞，促进抗体生成，提高机体对抗体敏感性，增强抗体作用。褪黑素作用于淋巴细胞，促进淋巴因子释放，提高免疫成分活性，促进淋巴细胞增殖，增加免疫器官重量[40]。针对病毒和寄生虫等外部应激原，褪黑素使尚未激活的免疫系统提前进入兴奋状态，实现早期免疫应答；对于短期或慢性免疫反应，如败血症性休克，褪黑素一方面进行负反馈调节，一方面作为抗炎因子发挥作用。褪黑素对于免疫系统多效、多样和复杂的作用，被形象的称为“免疫缓冲液”[41]。

3.4 褪黑素减少代谢紊乱产生的并发症

褪黑素作用到患病机体，有效控制疾病损伤，缓解代谢紊乱产生的并发症，加快机体恢复[38]。褪黑素减轻乳房炎对奶牛的伤害，降低牛奶体细胞数，缓解乳房炎症状，促进奶牛乳房恢复健康[42]。褪黑素缓解代谢紊乱造成的奶牛雌性繁殖障碍，长期改善小鼠、猪、牛、绵羊等卵母细胞和胚胎发育，改善线粒体功能，延缓卵巢的衰老，调节胚胎新陈代谢，促进胚泡形成。褪黑素作用于黄体细胞，刺激P4分泌，增加小鼠胚胎附植点数以及产仔数。促进子宫在胚胎附植的过程中形成接受态，利于胚胎正常发育，在胚胎早期植入过程中发挥重要作用。褪黑素穿过生理屏障作用于胎盘，减少氧化应激对胎盘的损伤，降低牛的流产率。

4 展望

代谢类疾病对奶牛养殖行业造成巨大损失，多年来，一直积极寻求治疗奶牛代谢疾病的方法，既要安全有效，又要符合市场对于成本的预期。褪黑素的生理功能有利于解决奶牛养殖行业诸多问题，其独特的功效为中国乳业开发新产品提供了思路，其对于奶牛生殖和免疫方面的积极作用已经得到证实，对于代谢紊乱的调节作用也在多个物种上得到验证，关于褪黑素与代谢的具体作用机制依然是研究的热点，缓解奶牛代谢疾病的药用价值还有待进一步研究。C