骆驼乳蛋白肽抗氧化应激研究

文/伍佰鑫 龙 云 罗 阳 孙 鏖 李剑波

（1 湖南省畜牧兽医研究所；2 湖南德农牧业集团有限公司）

乳蛋白通常是蛋白质序列中各种生物活性肽的前体，通过酶作用释放出来，具有多种功能，如免疫调节、抗炎、抗菌和抗癌等。与其他畜乳不同，骆驼乳能治疗儿童严重的食物过敏，对于抗糖尿病、抗中毒、抗病毒、抗菌、抗类风湿关节炎、抗癌等也具有明显的效果。机体氧化应激时，体内自由基水平增加，损伤脂类、蛋白质和DNA等重要生物分子。活性氧簇是氧化应激的一个方面，与类风湿关节炎、糖尿病、炎症、动脉粥样硬化和癌症等多种疾病有关。从天然蛋白质中提取的一些生物活性肽，对于抗氧化、抗炎、抗菌和抗高血压具有显著作用，且对人类几乎没有副作用。一些研究报道了骆驼乳的抗氧化作用，但针对的是发酵乳、全脂乳、总蛋白水解物或特定蛋白质（如乳铁传递蛋白）。关于骆驼乳蛋白质组分或多肽的抗氧化作用，则罕有报道。为了研究骆驼乳蛋白质组分和肽清除自由基、防止氧化应激的能力，日本进行了相关研究[1]，对于国内开发新型治疗肽、治疗氧化应激和相关疾病、促进骆驼乳产业的发展，具有重要的启发和参考价值。

1 研究方法

1.1 蛋白质分馏和消化水解

将生鲜骆驼乳在10 ℃、5 000 r/min条件下离心30 min，移除脂肪，上清液通过三层纱布过滤后获得骆驼乳蛋白（CMP）。一部分CMP冻干保存，其余部分用10%醋酸溶液搅拌均匀至pH值为4.6，30 ℃、5 000 r/min离心10 min。对于再悬浮颗粒（酪蛋白）和上清液（乳清蛋白），用1000 MWCO（分子量筛截）管进行透析、冻干，获得骆驼酪蛋白（CCP）和骆驼乳清蛋白（CWP）。在盐酸溶液（pH值为3.0）中，按50∶1（质量比）将蛋白质与（猪的）胃蛋白酶混合，37 ℃培养2 h后，85 ℃加热5 min，胃蛋白酶被灭活；室温下3 000 r/min离心10 min，将上清液pH值调至7.0，冷冻干燥。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）还原，分析骆驼酪蛋白（CCP）和骆驼乳清蛋白（CWP）消化液的水解程度；用考马斯亮蓝（CBB）观察蛋白质条带；用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对水解物进行纯化，采取C18色谱柱，梯度洗脱，214 nm处监控多肽的洗脱情况，收集多肽，真空干燥，使用时按所需浓度在蒸馏水中重新悬浮。

1.2 抗氧化活性测定

评定抗氧化活性有两种方法，即过氧化物清除法和2，2-二苯基-1-吡啶酰肼（DPPH）介导还原试验。前者是通过四唑氮蓝（NBT）为探针的黄嘌呤氧化酶（XOD）将黄嘌呤转化成尿酸，用此过程中产生的过氧化物来评定过氧化物清除活性，其清除能力用过氧化物还原NBT的程度表示，并在562 nm处测定分光光度值。具体操作步骤如下，100 μL反应混合物（包括40 μmol/L NBT、5 mmol/L黄嘌呤、10 mmol/L磷酸钠缓冲液系列浓度蛋白质或多肽，pH值为8.0）置于96 孔培养板中，对照组不加测试样；加入100μL XOD（5 mU），在562 nm（37℃）处，通过超高速生物轨迹II微型平板阅读器（瑞典）监测反应动力学20 min，减去空白值，结果用吸光度值的变化表示；每个样品有3 个平行，并重复测定2次。后者的操作步骤为，在薄层色谱板（5 cm×7.5 cm，德国）涂上6 μL蛋白质或多肽，晾干；喷涂含DPPH（1.8 mmol/L）的乙醇溶液；当含有清除的DPPH时，紫色背景会出现白色斑点。

1.3 氧化应激酵母模型

将生长于酵母浸出液蛋白胨葡萄糖（YPD）肉汤培养基中的酿酒酵母（YNN27）细胞悬浮于肉汤培养基中形成酵母悬浮液，将多肽（200 μg/mL）置于酵母悬浮液中，28 ℃培养1 h；加入2 mmol/L的过氧化氢（H2O2），将培养时间延长至48 h；在含有2 mmol/L过氧化氢（H2O2）的YPD琼脂平板上涂10 μL稀释培养物，28 ℃培养72 h后估算酵母菌落数，用CFU/mL表示。

1.4 多肽鉴定

将2 μL多肽溶液与2 μL α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-HCCA）基质饱和溶液混合到靶板上并风干，在1 000～3 200 Da质量范围内，采取正反射模式，用自弯曲速度质谱仪进行分析，通过对每个高峰值的主要前体离子进行MS/MS分析，鉴别多肽序列。

2 研究结果

2.1 骆驼乳蛋白的消化水解

用天冬氨酸蛋白酶（胃蛋白酶）分别水解CMP、CCP和CWP 2 h，冻干前进行透析，分析水解物对SDS-PAGE的还原作用。结果显示，CWP与CCP充分分离，所有蛋白质（CMP、CCP、CWP）被完全水解成分子量小于8 000 Da的肽；完整的蛋白质（CMP、CCP、CWP）显著减少了蓝二甲醛的形成，表明其具有清除过氧化物的能力，其中CWP清除过氧化物的能力最强，DPPH还原的结果与清除过氧化物的结果一致；CCP水解物比其完整蛋白质具有更强的清除过氧化物能力，CWP水解物清除过氧化物的能力与其完整蛋白质一致；CMP、CWP、CCP的水解物展示了显著的DPPH还原能力（产生了更强烈的白斑）。因此，它们不仅具有清除过氧化物能力，还具有还原自由基DPPH能力。

2.2 抗氧化肽的分馏

用RP-HPLC法，采取C18色谱柱将CMP、CWP和CCP的多肽分为4 个亚组分肽，命名为P1～P4。亚组分P1和P2称为快速洗脱肽（亲水），P3和P4则为慢速洗脱肽（疏水）。在浓度为40 μg/mL时，CMP的所有亚组分肽比其水解物都具有更强的清除活性；无论洗脱时间长短，CWP的亚组分肽都显示出最强的清除活性；CMP和CCP的亚组分肽则显示出从强（P1、P3）到中等（P2、P4）的变化。在各种蛋白质中，快速洗脱肽（P1、P2）表现出比慢速洗脱肽更强的DPPH还原能力；CMP和CWP的亚组分肽（P1、P2、P3）表现出比CCP亚组分肽更显著的DPPH还原能力。因此，快速洗脱肽（亲水）是比慢速洗脱肽（疏水）更强的抗氧化剂。

2.3 肽对酵母细胞氧化应激耐受性的影响

将真核酿酒酵母菌细胞和骆驼乳多肽共同培养，然后置于含2 mmol/L H2O2的琼脂板中，观察细胞存活情况。与对照组相比，各种蛋白质（CMP、CWP和CCP）亚组分肽的存活率（log CFU/mL）显著提高；CWP快速洗脱肽的存活率比慢速洗脱肽高，CMP和CCP慢速洗脱肽的存活率更高。胃蛋白酶使CMP释放出不同的抗氧化肽，其中许多作为胞内抗氧化肽起作用，说明某些抗氧化肽具有调节细胞内氧化还原状态能力，从而使活细胞对氧化应激产生耐受性。这些抗氧化肽很有可能会产生短暂的保护作用，以抵御随后的氧化状态。

2.4 活性肽序列

CCP水解物在活性高峰值组分（P1、P2、P3）中含有14 个肽，质量范围为913.12～2 951.68 m/z。CWP水解物在活性高峰值组分（P1、P2）中含有8 个肽，质量范围为1 168.52～1 861.14 m/z。在酪蛋白中，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白和κ-酪蛋白基本上不会产生肽，但β-酪蛋白能够产生许多肽。在乳清中，乳磷蛋白和富含半胱氨酸的蛋白质基本上不会产生肽，肽主要来自于乳铁蛋白。

总之，对骆驼乳蛋白质组分进行消化水解，可以释放抗氧化肽。虽然酪蛋白水解物产生了大量具有不同抗氧化能力的肽，但从乳清水解液中提取的肽比酪蛋白具有更高的过氧化物清除能力。酪蛋白肽（特别是高峰值P1中的酪蛋白肽）比乳清中的肽更能有效地降低DPPH还原能力。酪蛋白肽和乳清肽对H2O2胁迫的酵母细胞具有显著的保护作用。骆驼乳蛋白肽很可能参与了质子与自由基的交换，因此具有抗氧化能力。

3 讨论

中国是双驼峰的发源地和主要产地之一。全国约有骆驼20.5 万峰左右，主要分布在内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等省区约110 万km2的干旱草原上。《全国奶业发展规划（2016-2020）》中鼓励发展特种乳产业，丰富乳品市场，以满足人们生活水平日益提高对多种乳品的需要[2]。

骆驼的胃有三个胃室，第一室有20～30 个小气泡，称为“水脬”，可在饮水充足时储存水分；第二室储存草料等食物；第三室胃囊具有消化吸收功能。脂肪主要在驼峰聚集，而皮下没有脂肪。骆驼是所有动物中水转换量最低的动物，它能调整结肠水的吸收量及肾的排泄量，也不需要通过排汗来调节体温。传统放牧下的骆驼喜欢食用荒漠或半荒漠地区生长的（多刺）灌木和半灌木，能够适应低蛋白质饲料，对干物质、粗纤维及粗蛋白的消化能力比较强[3]。双峰骆驼（母）的平均泌乳期是14～16 个月，泌乳期内产奶量为1 254 kg。新鲜骆驼乳的pH值为6.5～6.7，含脂肪2.8 7%～5.3 8%、无脂固形物3.70%～10.36%、蛋白质3.0%～4.0%、乳糖3.4%～5.8%[4]。骆驼乳粉与双歧杆菌结合，可辅助治疗糖尿病[5]。

因此，骆驼已经进入学者的研究范围，无论药用还是食用，骆驼乳均具有开发潜力。通过加大舆论宣传和政策扶持，必定会促进骆驼（舍饲）养殖业的发展。C