高产酸醋酸菌的选育和耐酸机制研究进展

王丽婷，郭会明，洪厚胜

(1.南京工业大学 化学与分子工程学院，南京 211816；2.南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211816)

醋酸菌是一大类革兰氏阴性、严格需氧菌，主要栖息于含糖、酸或乙醇的原料中[1]。从1989年醋酸杆菌属(Acetobacter)被Beijerinck提出到目前为止，一共发现了19个醋酸菌属，其中Acetobacter，Gluconobacter，Gluconacetobacter，Asaia，Komagataeibacter5个属中均含有大量不同的菌种[2,3]。醋酸菌纲的微生物是严格需氧的，氧在呼吸代谢中是电子的最终受体，醋酸菌中除Asaia外，都能通过呼吸作用氧化乙醇，最终产生醋酸[4]。对醋酸菌进行分离、培养、保存、鉴定，筛选出高产酸的醋酸菌菌种，对生产高酸度醋具有重要的指导作用。

高酸度醋是指总酸含量为9%～25%(质量分数)的酿造醋，具有杀菌效果好、保鲜时间长、成本较低等优势[5]。采用液态深层发酵法直接转化食用酒精为醋酸是生产高酸度醋的重要方法[6]。我国高酸度醋的生产水平与世界先进水平相比仍有较大差距，而生产高酸度醋的关键是要掌握菌种、工艺、设备等方面的先进技术[7]。本文主要对高产酸菌种的选育和醋酸菌的耐酸机制进行了综述，为高酸度醋生产菌种的选育提供了研究思路。

1 高产酸菌种的筛选方法

1.1 自然选育

传统的筛选优良菌种的方法是采集发酵中的醋醅，进行梯度稀释得到不同浓度的发酵培养液，在含有碳酸钙的分离培养基上培养，可以在平板上产生透明圈的菌株，即为产酸的醋酸菌，然后进行初筛，对那些形态优良、H/C(透明圈直径与菌落直径的比值)值较大的单菌落划线纯化培养，并斜面保藏，对初筛的菌种进行产醋酸定性试验及产酸量测定，对高产酸的菌株划线纯化培养后并保藏[8]。

陈洋等从工业醋醅中分离筛选出5株耐乙醇、耐高温的醋酸菌菌株，通过发酵性能测定，发现其中FY4的耐受性最强，进行发酵罐发酵，发现在相同条件下FY4发酵特性始终优于工业菌株AS1.41，在37 ℃、10%乙醇的条件下，工业菌株AS1.41几乎停止产酸，而FY4仍有较高的产酸量[9]。

用这种传统的自然选育方法，使醋醅中的混合菌分离开，筛选出性状优良的高产酸菌株，这种方法简便易行，但是醋醅中的醋酸菌自然突变率很低，往往筛选得到的菌种的性状远不及食醋酿造工业上常用的纯种AS1.41和沪酿1.01。

1.2 诱变育种

诱变育种是使用化学方法或物理方法对菌株进行诱变，目的是定向筛选出所需优良性状的菌株。

贺小贤等对保藏的某菌株先进行微波诱变筛选出较高产酸的菌株，再用化学试剂盐酸羟胺进行诱变，最终筛选出的突变株的产酸量提高了43.55%[10]。彭桂兰等将通过传统分离培养方法得到的2种醋酸菌的菌悬液，放在波长为253.7 nm、15 W的紫外光下照射一定的时间，紫外诱变后得到的2种醋酸菌的产酸率都得到了提高[11]。吴晓英利用室温等离子体诱变技术选育了1株乙醇耐受性菌株，该菌株的醋酸产量比原始菌株提高了近4倍，同时发现该诱变菌株与原始菌株相比，细胞膜通透性变小，海藻糖合成量变大[12]。

诱变育种选育醋酸菌操作简单，突变频率高，有利于筛选新的优良菌种，但是有益突变频率较低，变异的方向和性质难以控制。

1.3 基因工程技术

王靖等发现巴氏醋杆菌AC2005的核酸修复酶uvrA的转录水平会随着菌体所处醋酸浓度的增大而增加，于是构建了uvrA基因敲除菌株和uvrA重组表达菌株，将菌株放置于一定的醋酸浓度下培养，比较它们的生长情况，uvrA重组表达菌株的生长量远高于原始菌株和uvrA基因敲除菌株，即使在较高酸度下，uvrA重组表达菌株的存活率也高于uvrA基因敲除菌株，在相同的发酵培养基中，uvrA重组表达菌株的产酸量比原始菌株高，而uvrA基因敲除菌株的产酸量比原始菌株低[13]，说明uvrA基因表达量的提高有利于醋酸菌的生长和产酸量的提高。脱氧核糖核酸(DNA)是细胞中重要的物质，当细胞处于高酸高温等不利条件下时，DNA会损伤，核酸修复酶可以使DNA恢复结构的完整性，所以uvrA的过表达可能有利于醋酸菌在高酸度环境下进行正常的生理代谢活动。

宋山等通过聚合酶链式反应(PCR)扩增乙醇脱氢酶基因片段，构建了乙醇脱氢酶过表达的基因工程菌株，该菌株的乙醇耐受性和平均产酸速率都优于原始菌株[14]。乙醇脱氢酶是醋酸菌细胞膜上氧化乙醇生产醋酸的关键酶[15]，该酶的过量表达会提高乙醇的转化率，防止胞外的乙醇流入胞内使醋酸菌死亡。

徐泽明将编码磷酸组氨醇氨基转移酶的hisl基因成功导入巴氏醋杆菌中，构建了耐乙醇的基因工程菌株T1，该菌株在9%乙醇浓度的条件下发酵产酸，产酸量几乎达到原始菌株的3倍[16]，将hisl基因过表达的菌株与亲本菌株进行发酵性能比较，发现乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的酶活均会影响到产酸量，酶活越高，产酸量越大，且在乙醇胁迫下醋酸菌的糖酵解途径和三羧酸循环途径会受到抑制，与碳代谢、氨基酸代谢、脂肪酸代谢相关的小分子代谢物含量会发生变化。

2 醋酸菌的耐酸机制

2.1 细胞膜的保护机制

Acetobacter和Komagataeibacter都是工业上常用的直接氧化乙醇产醋酸的醋酸菌属，但是Komagataeibacter的最高产酸量比Acetobacter要高。Goto等通过比较细胞膜磷脂的化学组分发现，Komagataeibacter的磷脂酰胆碱含量明显高于Acetobacter[17]。在Komagataeibacter的菌种发酵产酸过程中，Higashide等发现随着醋酸浓度的增加，细胞膜脂质中磷脂酰胆碱的比例增加，磷脂酰甘油的比例减少[18]。Hanada等发现磷脂酰乙醇胺氮甲基转移酶(phosphatidylethanolamine N-methytransferase，PMT)基因可以使磷脂酰乙醇胺转化为磷脂酰胆碱，与正常表达pmt基因的菌株相比，pmt基因中断突变株无法在细胞膜中产生磷脂酰胆碱，突变株的菌体生长速率变小，最大菌体密度下降[19]。因此，细胞膜中的磷脂酰胆碱含量被认为与醋酸菌的耐酸性有关。

亓正良通过酸激复合紫外诱变筛选得到1株高产酸高耐酸的突变菌株A.pasteurianusCICIM B7003-02，该突变株在醋酸发酵过程中，细胞荚膜的分泌减少，细胞膜中不饱和脂肪酸的比例增加，细胞膜的流动性增加[20]。因此，细胞膜的结构和组成会影响醋酸菌的耐酸性。

2.2 醋酸同化机制

Fukaya通过对突变株A.pasteurianus进行研究，发现aarA和aarC是醋酸耐受性基因，与三羧酸循环中的酶的编码有关，aarA编码柠檬酸合成酶[21]；aarC编码琥珀酰辅酶A转移酶和乙酰辅酶A转移酶，使琥珀酰辅酶A转化为琥珀酸，使胞内醋酸转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环[22]。Nakano发现顺乌头酸酶过表达菌株的产酸量与耐酸性都优于原始菌株[23]，顺乌头酸酶是在三羧酸循环中转化柠檬酸为异柠檬酸的酶。三羧酸循环偶联有氧呼吸产能途径——巴氏醋酸杆菌TCA循环其琥珀酰辅酶A到琥珀酸和苹果酸到草酰乙酸的代谢通路的酶不存在，要通过其他氨基酸回补途径运行并释放能量。胞内醋酸可以通过三羧酸循环途径被消耗，构建胞内完整且高效的三羧酸循环通路，会提高醋酸菌的耐酸性能。

2.3 醋酸泵出机制

AatA是细胞膜上的ATP结合盒(ABC)转运体蛋白，可以将细胞内的醋酸泵出[24]。Nakano等发现AatA基因中断菌株在较高醋酸浓度的环境中，菌体生长速率下降，对醋酸的耐受性降低。进一步研究发现，携带AatA的大肠杆菌转基因菌株对醋酸的耐受性得到了提高[25]。因此，AatA基因与醋酸菌的耐受性有关。

Matsushita发现醋酸菌A.pasteurianus胞内的醋酸浓度在呼吸底物存在的情况下较低，添加呼吸作用解偶联剂后，胞内醋酸浓度增加，外侧的膜囊泡通过呼吸作用产生的能量将被动运输进入胞内的醋酸泵出细胞外，内侧的膜囊泡通过呼吸作用积累醋酸，最终发现醋酸菌A.pasteurianus细胞膜上存在依靠质子动能势的醋酸外排泵[26]。

2.4 细胞对环境变化的适应机制

Okamoto-Kainuma发现当醋酸菌处在含有乙醇、醋酸、高温的环境中时，细胞内会产生多种分子伴侣蛋白[27]。其中，GroES和GroEL含有热休克启动子同源序列，这2种蛋白质的表达受到RpoH基因的控制，实验表明，RpoH基因中断突变菌株对乙醇、醋酸、温度变化的耐受性比原始菌株差，而过量表达GroES的菌株的产酸量比原始菌株高[28]。

醋酸菌在细胞膜内侧的酶的催化作用下，将乙醇氧化为乙醛再氧化为醋酸。乙醇脱氢酶(ADH)将乙醇氧化为乙醛，乙醛脱氢酶(ALDH)将乙醛氧化为醋酸，电子从乙醇和乙醛转移到辅酶Q，生成泛素醇[29,30]，最终泛素醇氧化酶将电子从泛素醇转移到氧中生成水[31]。当不能反应完全时，会产生活性氧(ROS)，如超氧阴离子和过氧化氢，Okamoto-Kainuma发现，在含有乙醇和醋酸的培养基中培养醋酸菌，过氧化氢酶调节因子突变株不能调节胞内过氧化氢浓度，其生长速率比原始菌株慢[32]。这些现象表明醋酸菌细胞内活性氧的快速降解有利于实现稳定高效的醋酸发酵。

3 结论与展望

高产酸醋酸菌的选育方法包括自然育种、诱变育种和基因工程技术。选育出高产酸的菌种，提高菌体的比生长速率，可以使单位时间内的产酸量提高，对高酸度液态醋的工业生产具有重要的指导意义。其中，通过基因工程技术改良菌种的方法更具有针对性，应该作为高产酸菌种选育的研究重点。

醋酸菌的耐酸机制十分复杂，目前对醋酸菌耐酸机制的认识并不透彻。已发现的醋酸菌耐酸机制，包括细胞膜的保护机制、醋酸同化机制、醋酸泵出机制、细胞对环境变化的适应机制4个方面。寻找这些机制的联系和纽带，研究这些机制之间的协作关系，探索新的耐酸机制，对全面地阐明醋酸菌的耐酸机制具有重要的意义，有利于指导高产酸菌种的选育，为高酸度醋生产的菌种选育方面提供了帮助。