地克珠利抗鸡球虫分子作用机理的研究进展

韩贞艳，毕菲菲，郝振凯，于咏兰，索 勋，刘贤勇

(中国农业大学动物医学院，北京海淀100193)

鸡球虫病是由一种或多种艾美耳球虫寄生于鸡肠道不同部位所引起的一种细胞内寄生虫病[1]。鸡球虫在田间广泛存在，凡有鸡的地方就有鸡球虫。鸡球虫病常见于规模化的商品养鸡场，发病率可达50%～70%，死亡率20%～30%，严重时可达80%。鸡球虫病导致饲料报酬率低，给养禽业造成巨大的经济损失[2]。

目前控制球虫病的主要方法依靠抗球虫药物。迄今用于临床的数十种抗球虫药物按其来源、化学结构和生产过程大致可分化学合成类药物、聚醚类离子载体抗生素和草药制剂等三大类。抗球虫药物主要通过影响细胞膜的功能(离子载体类)、阻碍能量代谢(喹诺酮，尼卡巴嗪等)、影响辅助因子的合成(磺胺类，氨丙啉等)、影响DNA(氟嘌呤类)或蛋白质的合成(均三嗪类)等发挥抗球虫作用[3]。但是随着抗球虫药物的广泛和长期使用，产生了十分严重的球虫耐药性问题。球虫耐药性的产生，一方面会导致药物的防治效果不佳或失败，药物的使用年限缩短；另一方面为了能有效控制球虫病的发生，需加大用药剂量，从而增加养殖成本，造成药物残留，同时增加对环境的污染。因此，球虫耐药性问题不仅是鸡球虫病的防治问题，更是食品安全和公共卫生问题。

地克珠利作为聚醚类的三嗪苯乙腈化学合成药物，抗球虫效果优于作用于第1代裂殖体的聚醚类药物和其他抗球虫药，具备高效、低毒、广谱的抗球虫效力。地克珠利在田间应用广泛应用是在1990年，但是1994年就出现了关于地克珠利抗药性的报道[4]。地克珠利耐药性的出现促使球虫国内外学者对地克珠利作用的分子机制展开了研究。

1 地克珠利抗鸡球虫作用相关基因或蛋白

地克珠利作用柔嫩艾美耳球虫后，柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子差异基因编码的同源蛋白主要包括：柔嫩艾美耳球虫的微线蛋白、表面抗原、肌动蛋白解聚因子、热休克蛋白90、刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)的激活蛋白激酶C受体和环形泰勒虫(Theileriaannulata)的甘油醛-3-磷酸脱氢酶等[5]。另外研究者们发现乳酸脱氢酶和丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶也很可能在抵抗地克珠利时发挥作用[6-7]。

1.1 乳酸脱氢酶 乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解途径中的关键酶，能够催化丙酮酸与乳酸之间可逆的氧化还原反应，产生能量，对于寄生虫的存活至关重要[5]。有研究结果表明，来自不同顶复门寄生虫的乳酸脱氢酶相对于其宿主的乳酸脱氢酶具有独特的动力学和结构特性，因此是诊断和药物筛选的潜在理想靶标[8]。有研究显示，柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子中乳酸脱氢酶的mRNA水平高于未孢子化的卵囊、孢子化卵囊和子孢子这3个发育阶段中的mRNA水平，乳酸脱氢酶的蛋白表达水平在第2代裂殖子中也最为突出，由此推测第2代裂殖子中乳酸脱氢酶的高度表达可能与其增加的能量需求相关联——因为乳酸脱氢酶在糖酵解中起着不可或缺的作用，而糖酵解途径是为内源发育阶段寄生虫提供能量的必需代谢途径，柔嫩艾美耳球虫可依靠此途径获取能量维持生存[9]。据报道，柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶的RNA仅在裂殖体中能观察到，表明其合成被限制在细胞内阶段[10]。

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶的蛋白编码区长度为996 bp，编码331个氨基酸。有研究显示，该基因在地克珠利耐药株与敏感株的差别为在第 305位有1个氨基酸的差异，敏感株为谷氨酸，而耐药株为甘氨酸[6]。在柔嫩艾美耳球虫的不同发育阶段，地克珠利敏感株乳酸脱氢酶mRNA的相对含量都明显高于耐药株；与之对应的，在第2代裂殖子阶段，地克珠利耐药株的乳酸脱氢酶蛋白的相对表达量比敏感株下降了55.32%。该研究结果表明，长期的药物诱导使柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶的基因表达水平发生了改变。由此推断，地克珠利抗球虫的作用机理可能和柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶参与的糖酵解途径有关。

1.2 蛋白激酶C受体蛋白 蛋白激酶C(PKC)是一种细胞质酶，在未受刺激的细胞中，蛋白激酶C主要分布在细胞质中，呈非活性构象，一旦有第二信使的存在，蛋白激酶C将成为膜结合的酶，它能激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控，同时也能作用于细胞核中的转录因子，参与基因表达的调控[11]。蛋白激酶C受体1(RACK1)在原核和真核生物高度保守，参与多种信号转导的调节，作用非常重要，其中在蛋白激酶C信号转导通路中，蛋白激酶C受体1能够与蛋白激酶C结合，调节蛋白激酶C的活性[12]。

柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白核苷酸序列全长1 264 bp，与来自弓形虫的蛋白激酶C受体蛋白在氨基酸水平有98%的同源性[13]。柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白位于柔嫩艾美耳球虫的第2代裂殖子中的细胞质和细胞核，表明其可能作为细胞内适配器广泛的参与细胞活动并促进柔嫩艾美耳球虫的侵袭力，是球虫无性生殖阶段第2代裂殖子阶段是必不可少的一种蛋白。研究者通过实时荧光定量PCR技术检测柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白在第2代裂殖子阶段发育过程中的转录水平，发现地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白 mRNA的表达水平下降了81.3%[13]。柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白mRNA表达水平的下调可能会引起下游的蛋白质功能发生障碍，抑制与入侵相关的分泌蛋白表达的信号转导。地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白mRNA表达水平的下调表明，柔嫩艾美耳球虫蛋白激酶C受体蛋白可能存在地克珠利作用的靶点。

1.3 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)主要参与细胞的糖酵解途径。近年来越来越多的研究表明，甘油醛-3-磷酸脱氢酶不仅是一种糖酵解酶，还是一种多功能蛋白，参与许多亚细胞活动，主要有催化微管聚合，参与蛋白磷酸化修饰、膜融合和膜转运，促进细胞凋亡，调节蛋白质的表达以及参与DNA修复损伤作为转铁蛋白受体等，在其他多细胞生物上，甘油醛-3-磷酸脱氢酶的过量表达会导致细胞凋亡[14]。

地克珠利作用后，柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶mRNA表达水平显著提高，第2代裂殖子细胞核中出现了大量的甘油醛-3-磷酸脱氢酶蛋白，并且柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子出现细胞核染色质明显减少、发生异染色质化，凝集成大的黑色团块、与核膜分离并发生趋边化，线粒体脊模糊、断裂，胞质中出现了大量的空泡等细胞凋亡的典型症状[15]。地克珠利引起的柔嫩艾美耳球虫的细胞凋亡可能与第2代裂殖子甘油醛-3-磷酸脱氢酶的累积有很大关系，地克珠利通过作用于甘油醛-3-磷酸脱氢酶发挥抗球虫作用。

1.4 热休克蛋白90 热休克蛋白90(Hsp90)在应激耐受性，新合成的蛋白质折叠和各种生物的生长中起着重要作用[16]。在弓形虫中，热休克蛋白90对入侵宿主细胞和在宿主细胞内生长是必需的[17]；在恶性疟原虫中，通过使用药物格尔登霉素(GA)进行的抑制试验证实了热休克蛋白90参与恶性疟原虫在人类红细胞中的生长[18]；有研究者用柔嫩艾美耳球虫热休克蛋白90产生的抗体预孵育子孢子，然后感染细胞，结果发现子孢子入侵率下降了75%，表明热休克蛋白90能够影响柔嫩艾美耳球虫的侵袭能力[16]。

Shen[19]等研究了地克珠利对球虫第2代裂殖子热休克蛋白90的作用，试验中两组鸡分别接种柔嫩艾美耳球虫卵囊，试验组鸡从接种后96-120 h饲喂含1 mg/kg地克珠利饲料，对照组一直饲喂不含地克珠利饲料，收集接种柔嫩艾美耳球虫120 h后盲肠中的第2代裂殖子，提取总RNA，并表达纯化出热休克蛋白90蛋白，然后利用qPCR的方法检测热休克蛋白90 mRNA的表达水平。结果发现，地克珠利治疗组热休克蛋白90 mRNA的表达水平比对照组下降了29.7%，蛋白质印迹分析发现地克珠利治疗组的第2代裂殖子的热休克蛋白90蛋白水平与对照组相比降低了50.0%。这些结果表明，地克珠利使第2代裂殖子中的热休克蛋白90的表达水平下调，据此推测热休克蛋白90是抗球虫感染中一个潜在的地克珠利药物靶标。

1.5 丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶 蛋白磷酸酶是能够催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统[20]。可逆蛋白质磷酸化和去磷酸化在细胞生命的大多数方面起着重要作用，包括细胞生长调节，分化，衰老和凋亡[21]。人类中有3种主要的蛋白磷酸酶，分别是酪氨酸磷酸酶(PTPase)、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PPase)和双重特异性磷酸酶(DSPase)[22]。根据去磷酸化的氨基酸残基的不同，蛋白磷酸酶分成蛋白酪氨酸磷酸和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶。丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶(PP5，PPP5C)是哺乳动物组织中广泛表达的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶基因家族的成员之一，已经证实丝氨酸/苏氨酸5型蛋白磷酸酶包含调节四肽多肽重复(TPR)结构域，并且在许多细胞应答中的信号通路中起作用[20]。

Zhou等[7]研究地克珠利对丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的作用时，利用反转录聚合酶链反应和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆出柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶，并采用实时荧光定量PCR检测了柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表达水平。结果发现，地克珠利处理组柔嫩艾美耳球虫丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶的mRNA表达水平比未加地克珠利的对照组下降了51.4%。地克珠利作用后还引起柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子的凋亡，其机制可能与丝氨酸/苏氨酸5型蛋白磷酸酶的下调表达有很大关系。球虫产生抗地克珠利药物的靶点很有可能位于丝氨酸/苏氨酸Ⅴ型蛋白磷酸酶这个基因上。

1.6 微线蛋白 微线是位于所有顶复门寄生虫入侵阶段前端的分泌细胞器，宿主细胞刺激后，微线蛋白在寄生虫顶端分泌[23]。研究表明，一些微线蛋白质作为专门的粘附素起作用，在寄生虫运动和附着宿主细胞中有重要作用[24]。

地克珠利作用柔嫩艾美耳球虫后，柔嫩艾美耳球虫中的5种重要的与球虫侵袭相关的微线蛋白的mRNA表达均发生了下调，其中微线基因1下调65.63%，微线基因2下调64.12%，微线基因3下调56.82%，微线基因4下调73.48%，微线基因5下调78.17%[25]。地克珠利作用球虫后，影响了球虫第2代裂殖时期微线基因的表达水平，推测地克珠利通过作用与入侵相关的微线基因发挥抗球虫作用，微线基因可能是地克珠利作用的靶基因。

2 展望

当前对地克珠利抗鸡球虫的分子作用机理研究着重于研究与地克珠利作用可能相关的基因和蛋白。本文所述的地克珠利抗鸡球虫作用相关基因和蛋白是球虫入侵、代谢及信号传导途径中的关键分子。地克珠利作用后，这些基因或蛋白的表达量发生了不同程度的变化，地克珠利作用的位点很可能位于其中某个基因或蛋白上，但是有关地克珠利确切的调控机理及其相互之间的作用关系还需要进一步深入的研究。

随着分子生物学技术的快速发展，更多新技术在抗球虫药物领域得到运用，有望真正揭示球虫抗地克珠利的分子机制。比如，可以通过实验室分离或诱导地克珠利耐药球虫株，比较药物敏感株和耐药株在这些地克珠利可能作用的基因，筛选可能的耐药基因的突变区域和突变位点，寻找地克珠利作用的靶基因位点，并通过转基因技术对这些基因位点进行验证。地克珠利以及其他抗球虫药物的靶基因或靶基因位点的发现，将对抗球虫新药的研发具有重要的指导意义。