热痹康胶囊的提取工艺研究

江丽芬 方建康 庞学丰

（广西中医药大学附属瑞康医院药学部，广西 南宁 530011）

热痹康汤是庞学丰主任医师研究且运用了十几年的经验方，由秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤、黄柏、苍术等组成，对类风湿关节炎的治疗或辅助治疗有很好的疗效。在现代类风湿关节炎的治疗上，中医药展现了强力有效的一面，也为类风湿关节炎的治疗描绘了美好的前景［1］。故本文以龙胆苦苷含量为评价指标，采用正交试验法考察水提影响因素，优化出水提工艺条件，为研究热痹康胶囊治疗类风湿性关节炎的物质基础、探讨其作用机制及其临床应用与开发奠定基础。

1 资料与方法

1.1 材料与仪器 ACS-JZ高密度计数计重天平（深圳信诺普衡器）；AL204分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；HH-S8电热恒温水浴箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；WFH-205B可见透射紫外反射仪（上海精科实业有限公司）；CQ-250超声波清洗机（上海跃进医用光学器械厂）；DLSB-5L/10低温冷却液循环泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SHZ-D循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；LC-20AT岛津高效液相色谱仪（岛津国际贸易上海有限公司。）

1.2 实验方法

1.2.1 防风的定性鉴别 取本品粉末 5 g，加甲醇30 mL，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇10 mL使溶解，取滤液浓缩至1 mL作为供试品溶液。另取防风对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。取阴性品粉末5 g，同法制成阴性溶液。

吸取上述 3种溶液各 5 μL，点于同一硅胶 G薄层板上，以三氯甲烷 ∶甲醇（4∶1）为展开剂展开，取出，晾干，置紫外光灯 254 nm下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照试验无干扰。

1.2.2 桂枝的定性鉴别 取本品内容物5 g，加乙醚20 mL，振摇 15 min，放置1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加丙酮1 mL溶解，作为供试品。取桂枝药材1 g，同法制成对照药材。另取缺桂枝的阴性样品，同法制成阴性对照品。吸取供试液、对照药材及阴性对照液各 6 μL、3 μL、3 μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以石油醚30～60℃-乙酸乙酯 (17∶3)为展开剂，展开取出，晾干。喷以2、4-二硝基苯肼甲醇溶液，日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色(橙色)的斑点，阴性对照液无此斑点。

1.2.3 黄柏的定性鉴别 取供试样品粉末1 g加甲醇10 mL，超声20 min，放置，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品黄柏药材 0.1 g，同法制成对照药材。另取缺黄柏的阴性样品1 g，同法制成阴性对照品。取供试品溶液 10 μL、药材对照品 5 μL、阴性对照液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-异丙醇-水 (6∶3∶2∶1.5∶0.3) 为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365 nm)下检视。供试品色谱中，在与药材照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照液与其相应位置无显色斑点。

1.2.4 桑枝的定性鉴别 取本品 2 g，精密称定，加甲醇20 mL，超声处理 30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL，作为供试品溶液。取桑枝对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。另取缺桑枝的样品1 g，同法制成阴性对照。分别吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯 (365 nm)下观察。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.2.5 秦艽的含量测定 （1）色谱条件：柱温：25℃；流动相：乙腈∶0.1%冰醋酸（8∶92）；流速：1.0 mL/min，检测波长：254 nm，理论板数按龙胆苦苷峰计算应不少于3000。

（2）对照品溶液的制备：精密称取龙胆苦苷对照品适量，加乙醇制成 1 mL含10 μg的溶液，即得。精密吸取 5 μL，进样，测定，结果见图 1。

图1 对照品图谱

（3）供试品溶液的制备：取本品约 1 g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 mL，密塞，超声处理 30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密吸取5 μL，进样，测定，结果见图2。

（4）阴性干扰试验：按照处方中药味的比例，配制不含葛根的群药，按其工艺制成阴性制剂，再按照上述供试品溶液的制备方法制成阴性液，精密吸取5 μL，进样，测定，见图3。结果阴性液在龙胆苦苷对照品相同的保留时间处未显色谱峰，表明无干扰，方法专属性良好。

（5）线性关系考察：精密吸取龙胆苦苷10、20、30、40、50、60 μg/mL的对照品溶液 20 μL分别注入液相色谱仪，测定龙胆苦苷色谱峰面积依次为320778、500334、673179、867796、1058561、1246075，以龙胆苦苷进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：y=185590x+128209，结果表明龙胆苦苷在0.2075～1.2047 μg具有良好的线性关系，见图4。

图4 龙胆苦苷色谱峰面积与进样量线性关系图

（6）稳定性试验：取同一批样品，制备供试品溶液，在室温下放置0、1、2、4、8、12 h后分别进样，测定峰面积，结果峰面积平均值为 653079，RSD为1.0%，表明待测组分浓度在12 h内无明显变化，化学性质稳定。

（7）精密度试验：取同一浓度对照品溶液，按照上述色谱条件，分别精密吸取5 μL，连续进样6次，测定峰面积。结果峰面积平均值为 958834，RSD为 0.03%（n=6），结果表明仪器精密度良好。

（8）重复性试验：取同一浓度供试品溶液，依法平行制备5份供试品溶液并测定其含量，结果求得龙胆苦苷平均含量为 0.786 mg/g，RSD为 0.9%（n=5）。

（9）回收率试验：取已知龙胆苦苷含量的样品 6份，研细，取约 1 g，精密称定，分别精密加入葛根素对照品约0.8 mg，照供试品溶液的制备方法制备溶液并依法测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 回收率试验 （n=6）

结果表明，本方法回收率较好。

（10）样品含量测定：分别取九份样品 1 g，依法制备成相同的浓度并测定其龙胆苦苷的含量，结果见表2。

表2 9份样品含量测定

1.3 正交试验——工艺条件优选 （1）因素水平：根据传统的中药制剂的常规方法及生产的实际经验，选用水煎煮提取工艺的主要因素即加水量，第一次煎煮前渗泡时间，煎煮时间（h），煎煮次数，每个因素各选三个水平，选用L9（34）正交试验安排试验因素水平［3］，见表1。

表1 因素水平表

（2）试验方法：按处方比例称取秦艽、防风、桂枝、威灵仙、制川乌、地龙、桑枝、葛根、忍冬藤等各种药材共9份，每份160 g，分别按 L9(34)正交试验安排 9次试验，合并煎煮液，精滤，浓缩，置已干燥恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣在105℃干燥4 h，放置干燥器内冷却30分钟，迅速称定重量，干膏固体总量分别为 14.32、 21.97、 33.21、 33.77、 17.67、 30.52、 24.79、32.17、18.07 g。

表2 正交试验表

结果：D＞A＞B＞C，最佳工艺：A2 B3 C1 D3

从上表的实验数据进行方差分析结果见表3。

表3 方差分析表

（3）正交试验优选结果：通过正交试验直观分析和方差分析结果表明：ABCD各因素对本品提取物总固体总量都有不同程度的影响。从分析结果表明煎煮次数D对本品影响最大，其次是加水量A，煎前浸泡时间B因素和煎煮时间，影响顺序为 D＞A＞B＞C，A2B3C1D3为最佳工艺，即加10倍量水，第一次先浸泡 60 min，煎煮提取 3次，每次 1 h。

（4）验证试验：按优选的最佳提取工艺制备3批样品，测定样品的总固体量和龙胆苦苷含量，实验结果如下表4。

表4 水提取工艺验证结果

验证结果表明，按水提取工艺A2B2C2D3所提取的总固体量接近正交试验的最大值（33.77），表明此工艺稳定合理可行。

2 结果

采用正交设计，确定了水提取工艺的最佳条件，即称取提取的药材，加入药材量 10倍体积的水，加热煎煮提取3次，每次2 h，其中第一次提取前先将药材浸泡30 min。验证试验结果表明此提取工艺稳定合理可行，可进行规格生产。