针刺肾俞足三里干预绝经后骨质疏松症大鼠模型的影响※

李 俐郑旭仙曾雅芬余晓雯吴明霞*

（1 福建中医药大学附属第二人民医院针灸科，福建 福州 350003；2 福建中医药大学针灸学院，福建 福州 350122）

随着经济、医疗水平的提高，人类的平均寿命不断增加，骨质疏松在老年群体中普遍存在。绝经后骨质疏松症 (PostmenoPausal osteoPorosis，PMOP)又称 Ⅰ 型骨质疏松症，是指由于绝经后妇女卵巢生理功能以及雌激素水平的下降，使得骨代谢过程失衡，骨吸收大于骨形成而导致的骨量低下、骨组织显微结构破坏、骨强度降低、骨脆性增加。临床主要以疼痛、关节变形甚则骨折为主要表现的一种全身性骨疾病［1］。因其有较高的致残率，严重威胁到患者的生命健康及生活质量。中医学认为，骨的生长、发育主要受肾精盛衰影响，而妇女绝经后肾精亏虚故易发“骨痿”“骨痹”“骨枯”等病症。目前临床上主要是运用药物疗法，但药物治疗所产生的副作用较多，部分患者不能耐受或者不能接受。本实验通过观察针刺干预对绝经后骨质疏松症大鼠胫骨骨密度、腰椎 c-myc、Cyclin D1和 Runx2 mRNA表达的影响，探讨针刺防治绝经后骨质疏松症的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 7周龄SPF级雌性SD大鼠50只，动物许可证号（SCXK（沪）2012-0002），由福建中医药大学实验动物中心提供（许可证号：SYXK（闽）2009-0001）。喂养 1月后，按随机数字表法分为造模组 30只，假手术组10只和空白组10只。

1.2 主要试剂、材料及仪器 试剂及材料：cDNA一链合成试剂盒逆转录试剂盒（Vazyme公司）、PCR Mix PCR聚合酶（Vazyme公司）、Trizol RNA提取试剂盒（Vazyme公司)、琼脂糖-凝胶电泳用（英国OXOID公司）、水合氯醛（福建中医药大学附属第二人民医院提供）。仪器：双能X射线骨密度仪（美国 HOLOGIC DISCOVERY CI型）、洗板机 (Wellwash 4 MK2，Thermo芬兰)、基因扩增仪（美国 Applied Biosystems 9700 PCR System）、酶标仪（DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo，芬兰，分析软件：Ascent software for Multiskan）、水浴锅（上海精宏）、华佗牌一次性使用无菌针灸针（0.25 mm×13 mm，苏食药器械生产许2001-0020号）。

1.3 研究方法

1.3.1 模型制作 参照文献［2］方法造模：将 30只大鼠用10%的水合氯醛 (3 mL/kg体质量)腹腔注射麻醉。腹位固定，沿腹部腹正中线 (腹白线)剑突下2 cm处备皮，以安尔碘消毒，依次切开皮肤、肌肉、腹膜，用镊子轻轻将乳白色组织提出腹腔，即可见被包裹的卵巢，分离后钳夹、结扎输卵管，摘除卵巢。腹腔给予青霉素生理盐水 (2万U/mL)抗炎，分层缝合皮肤，盖软毛巾保温待麻醉苏醒。术后连续做1周阴道图片，检测卵巢是否切除干净。假手术组10只造模切除卵巢附近的与卵巢大小相近的脂肪组织代替双侧卵巢。大鼠术后均予腹腔注射青霉素生理盐水 (2万U/mL)抗炎，每日注射0.5 mL，连续3日。

术后造模组死亡2只，死亡原因考虑麻醉药过敏或麻醉时间过长引起体温过低死亡。术后假手术组死亡2只大鼠，死亡原因考虑同上述。将造模组同上述随机分组方法分为模型组9只，肾俞足三里组10只，非经非穴组9只。造模后饲养90 d。

1.3.2 治疗方法 肾俞足三里组：取肾俞和足三里穴，定位参照《实验针灸学》［3］。穴位常规消毒后，用 0.5寸毫针进行针刺，行提插捻转补法，留针 30 min，每隔10 min行针1次，每日1次，10次1疗程，疗程间期5 d，共治疗6个疗程，持续90 d。

非经非穴组：取非经非穴进行针刺，定位参照《实验针灸学》［3］。针刺操作同穴位组，余同穴位组。模型组、假手术组、空白组除套头、抓取操作外，不给予任何处理。

操作由福建中医药大学两名针灸推拿学研究生配合进行，保证各组接受2名操作者治疗的大鼠只数相同，期间，各组动物均正常饮食，自由饮水。

1.3.3 标本采集 治疗结束后，处死大鼠，完整摘取右胫骨，剥离骨周围软组织，生理盐水纱布包裹，放入 PE密封袋，用于骨密度的测定；取第1～3腰椎，无菌纱布浸透0.9%盐水后包裹，于液氮中保存，用于mRNA的检测。以上标本取材时均按分组编号做好标记。

1.3.4 检测指标 （1）骨密度：治疗结束后将大鼠处死，取右侧胫骨，采用美国HOLOGIC DISCOVERY CI型双能X线骨密度仪，测定大鼠右胫骨、右胫骨上端骨密度。由福建省中医药研究院提供检测服务；（2）mRNA测定：PCR法检测过程如下：取 L1～L3椎体加 200 μL Trizol，研磨后加入800 μL的Trizol溶液，混匀后于室温下静置15 min，加氯仿，静置10 min后离心。提取上层水相并加入等体积的异丙醇，混匀后置于低温环境30 min，后离心10 min，去上清液，留取沉淀。加乙醇振荡洗涤RNA沉淀1次，后离心5 min。再水溶解。用HiScript®II RT SuperMix for PCR进行逆转录反应。由福州沃森生物技术有限公司合成内参及引物，内参照序列：GAPDH(Rat)140bp上游：5’-ACGGCAAGTTCAACGGCACAG-3’。引物序列：Runx2(rat)385bp上游：5’-TGCCATCGTGTGTGAACATAAGA-3’，下游：5’-CGTGTGTCAGAAGGAGTCAGGATG-3’， c-myc(rat)220bp上游：5’-CCGTTCAAGCAGATGAGCAC-3’，下游：5’-GCCAAGGTTGTGAGGTTAGG-3’，cyclin D1(rat)173bp上游：5’-GCGGATGAGAACAAGCAGAT-3’，下游：5’-CGGTAGCAGGAGAGGAAGT-3’， 下 游 ： 5’-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3’。预变性（94℃，5 min）、变性：（94℃，30 s)，退火：（58℃，30 s)、延伸（72℃，20 s)、重复变性→延伸（30个循环）、延伸（72℃，7 min)。反应完成后取4 μL PCR扩增产物于 0.9%琼脂糖凝胶电泳进行检测30 min后，凝胶成像仪检测条带。

1.3.5 统计学方法 采用 SPSS 18.0统计软件进行分析，各指标计量数值均用均数±标准差（x±s）表示，各组数据服从正态分布且方差齐性使用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验；任一组数据不符合正态分布的，对秩转换后产生的新变量进行 SNK检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠右胫骨骨密度测定结果比较 结果如图1（SPSS 18.0统计学软件制图）所示：与假手术组比，模型组骨密度下降（P＜0.05）。与模型组相比，肾俞足三里组骨密度有显著性差异（P＜0.05），而非经非穴组差异无统计学意义。

图1 大鼠胫骨骨密度比较

2.2 各组大鼠胫骨上端骨密度测定结果比较 结果如图2显示：与假手术组相比，模型组骨密度均值降低（P＜0.05）。与模型组相比，肾俞足三里组骨密度均值有显著性差异（P＜0.05），而非经非穴组骨密度均值差异无统计学意义 （P＞0.05）。

图2 大鼠胫骨上端骨密度比较

2.3 mRNA测定凝胶成像仪检测条 如图3所示。

图3 mRNA测定凝胶成像仪检测条

2.4 各组大鼠腰椎c-myc、Cyclin D1和Runx2 mRNA表达结果比较

2.4.1 c-myc mRNA测定比较 结果如图 4所示：与假手术比较，空白组（P＞0.05），模型组（P＜0.05），肾俞足三里组 （P＞0.05），非经非穴组 （P＜0.05）。

图4 c-myc mRNA灰度值比较

2.4.2 Cyclin D1 mRNA测定比较 结果如图5所示：Cyclin D1灰度值均值非经非穴组＞模型组＞假手术组＞肾俞足三里组＞空白组（P＞0.05），差异均无统计学意义。

图5 Cyclin D1灰度值比较

2.4.3 Runx2 mRNA测定比较 结果如图 6所示：与空白组相比，模型组（P＜0.05）；与模型组相比，肾俞足三里组 （P＜0.05）、非经非穴组 （P＜0.05）；与非经非穴组相比，肾俞足三里组（P＞0.05）。

图6 Runx2灰度值比较

3 讨论

绝经后骨质疏松症（PMOP）多认为是由于卵巢功能减退而导致的一种常见骨骼疾病，因其伴随着骨强度下降、骨折易感性增加，使得致残率与致死率较高。研究发现雌激素是通过受体以及细胞因子的介导，从而影响成骨细胞与破骨细胞的凋亡，并可通过促进体内骨保护素的水平升高，降低骨保护素受体的水平，从而抑制了破骨细胞对骨的吸收［4］。绝经后妇女因雌激素水平的降低，破骨细胞活性增强，成骨细胞受抑制，骨吸收和骨形成平衡失调，导致骨量丢失，引起骨质疏松［5］。根据其临床表现及发病的部位，应当属于中医学“骨痿”“骨痹”“骨枯”的范畴。《素问·痿论》曰：“肾主身之骨髓。肾气热，则腰背不举，骨枯而髓减，发为骨痿。”《备急千金要方·骨极》指出：“骨极者，主肾也，肾应骨，骨与肾合，……若肾病则骨极，牙齿苦痛，手足疼，不能久立，屈伸不利，身痹脑髓痠。”肾为先天之本，主骨生髓藏精，其充在骨，女子七七“天癸”绝，肾精逐渐衰少，骨髓化源不足，不能濡养骨骼而致骨骼脆弱无力，继而出现腰背酸痛、胫膝酸软等骨质疏松症的典型表现［6］。PMOP的发病根源皆在于肾，病机关键是肾虚精衰，骨髓亏虚，骨骼失养。又如《医宗必读》指出：“阳明虚则血气少，不能润养宗筋，故弛纵，宗筋弛纵则带脉不能收引，故足痿不用。”《灵枢·决气》曰：“谷入气满，淖泽注于骨。”脾为后天之本，气血生化之源，妇女在绝经前，身体脾胃虚衰，运化受碍，气血乏源，血不化精，无以充养先天之精，则肾虚经绝而骨痿，致骨骼疏松发生。故本病与脾胃的关系也密切。因此治疗应补肾虚同时兼顾脾胃。本实验取肾之背俞穴肾俞，配合胃之下合穴足三里，起到培肾壮骨、健脾益气、强壮体质的作用。针灸治疗绝经后骨质疏松症的疗效及阐明其作用机理，仍然是目前针刺治疗PMOP研究的主要内容之一。

本实验结果显示，与假手术组相比，模型组胫骨、胫骨上端骨密度均降低（P＜0.05），证实造模能降低骨密度。与模型组相比，肾俞足三里组大鼠胫骨、胫骨上端骨密度均升高（P＜0.05）；非经非穴组胫骨、胫骨上端骨密度差异均无统计学意义（P＞0.05）。从结果可以看出，针刺肾俞、足三里可使胫骨、胫骨上端骨密度升高，这表明针刺肾俞、足三里穴可改善绝经后骨质疏松的骨密度降低。本研究从实验的角度验证了针刺肾俞、足三里穴可改善绝经后骨质疏松的骨密度降低。结合其他实验研究［7-9］都得出针刺相关穴位可以改善去卵巢大鼠的骨密度水平，其结论与我们的研究结论一致。

作为 Wnt/β-catenin通路的两个下游靶基因，c-myc和Cyclin D1通过一系列的转录后，可使细胞进入S期，促进成骨细胞增殖分化。c-myc通过基因启动子上的TCF4结合位点与 β-catenin结合，调节细胞周期，促进G1到S期的转变，从而促进成骨细胞的分化增殖。Cyclin D1作为细胞周期增殖的关键蛋白，促进细胞周期从G1期到 S转换，从而调节细胞分化增殖［10-11］。另外，Runx2作为调节成骨细胞分化和骨发育的关键转录因子，能调控膜内和软骨内骨化成骨，促进骨形成［12］。

根据实验的结果显示，肾俞足三里组 c-myc mRNA表达与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05），说明针刺肾俞、足三里穴产生的作用能防治绝经后骨质疏松症大鼠模型。针刺肾俞、足三里对 Cyclin D1 mRNA表达差异均无统计学意义，延长实验周期或者扩大样本量也许能进一步发现他们的关系，也可能是针刺肾俞、足三里的作用靶向并非是 Cyclin D1。模型组大鼠腰椎Runx2 mRNA较空白组降低，提示腰椎中 Runx2 mRNA表达降低可能是绝经后骨质疏松症的发病机制之一，通过针刺肾俞、足三里穴可能通过使腰椎中Runx2 mRNA表达升高而防治 PMOP，肾俞足三里组Runx2灰度值虽略大于非经非穴组，考虑受样本量、干预时间限制，目前Runx2灰度值还不足以体现差异。

“肾主骨”，肾气虚衰是绝经后骨质疏松症的根本病因，肾俞穴是肾脏之气输注在背腰部的腧穴，针之可补肾壮骨、强壮体质，固护人体先天之本。足三里为胃腑之下合穴，针之可补益脾胃、强壮机体、培补后天。中医从整体出发，顾先天及后天之本，改善 PMOP病机，从而达到改善骨质疏松的治疗目的。本实验结果提示该腧穴配合对临床具有较好的参考价值。