小鼠诺如病毒检测方法团体标准的编制

李晓波，付 瑞，王 吉，王淑菁，王莎莎，李 威，秦 骁，黄宗文，贺争鸣，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 102629)

小鼠诺如病毒在实验小鼠中有很高的感染率，其对动物本身及实验结果均会产生较大影响，目前我国还没有制定小鼠诺如病毒的相关标准。中国实验动物学会结合实际需求提出了小鼠诺如病毒检测方法团体标准的研究和撰写，由中国食品药品检定研究院和广东省实验动物监测所共同完成。本文介绍了该标准编制的背景、法律法规依据，并对标准内容的设置进行了解释。

1 编制背景

2003年Karst等人通过脑内连续传代的方法，从死亡的先天免疫缺陷小鼠(RAG2-/-/STAT1-/-) 体内分离得到一种新的病原体，经鉴定该病原体属于杯状病毒科，诺如病毒属，命名为小鼠诺如病毒1型(murine norovirus,MNV-1)。小鼠死于脑炎、脑膜炎、肝炎以及肺炎等致死性感染[1]。随后其他MNV毒株相继被分离，这些新发现的毒株其病原特性与原始分离株不尽相同[2]。

MNV在实验小鼠中有很高的感染率。其作为一种胃肠道病原体，主要通过粪口途径传播，也可经呼吸道传播，小鼠经口感染MNV后可持续通过粪便向外排毒，排毒时间可达8周以上，病毒可在粪便中及潮湿物体表面存活40 d以上，同时各种品系小鼠均易感，因此很容易在实验小鼠群体中形成爆发流行，据称MNV是目前实验小鼠中感染率最高的病毒，其感染率是排在第二位的小鼠细小病毒的10倍[3]。Masaaki等于2009年首次报道了MNV在日本的感染，其对来自6个实验小鼠种群的37份小鼠粪便样本进行检测，MNV阳性率为22%(8/37)[4]。Kim等对来自韩国的15个动物设施的11个近交系或封闭群的745份小鼠血清调查表明，总MNV抗体阳性率为15%(112/745)，其中包括内部繁殖种群，外购动物及基因修饰动物[5]。Ohsugi对来自日本和美国的29个动物设施的96只小鼠调查表明，日本普通级小鼠和SPF级小鼠中MNV抗体阳性率分别为67.3%(37/55)和39.1%(9/23)；美国普通级小鼠阳性率为62.5%(10/16)，SPF级小鼠中未检出(0/2)[6]。Charles River对客户送检的42000份小鼠血清中的MNV进行检测发现其阳性率为32.4%[3]。Mahler等对来自西欧的100多个动物设施中实验大、小鼠流行的24种病毒及支原体的检测显示，在众多病原体中，MNV是感染率最高的病原体，阳性率为31.8%(2670/8394)[7]。我国MNV的感染情况也不容乐观，袁文于2010年首次报道我国广东省实验小鼠MNV感染率为37.38(77/206)，且不同设施来源的病毒基因型有差异[8]。中国食品药品检定研究院对2014和2015年来自全国17个实验动物生产和使用单位的实验小鼠进行了MNV的监测，结果显示MNV抗体阳性率为18.3%(204/1114)，核酸阳性率为34.8%(181/520)[9]。有报道对北京地区的600只小鼠检测显示MNV感染率为11.67%，阳性小鼠主要来自动物实验设施(阳性率30.94%)，而商品小鼠的感染率仅为0.27%[10]。

MNV的感染会对实验动物造成很大危害。MNV感染会导致免疫缺陷小鼠(如Stat1-/-和IfnR-/-小鼠)组织发生系统性病变，导致肝、脾、肺、小肠等产生炎症和坏死[11]；免疫功能正常小鼠感染MNV后虽然大部分不表现临床症状，但有报道野生型129小鼠在感染MNV后出现肝的轻到中度损伤，小肠淋巴结生发中心增大，脾红髓增生，白髓活化等病理改变[12]。很多研究通过免疫组化，免疫荧光，原位杂交等方法证实MNV能够感染不同组织里的巨噬细胞和树突状细胞，包括肝、肺、肠系膜淋巴结、腹膜、小肠、脾和主动脉等，说明不论免疫缺陷小鼠还是正常小鼠均可能发生MNV的全身性播散[13-15]。以上事实表明MNV感染对小鼠组织的损伤不容忽视。

MNV的感染会对实验结果产生较大影响。随着对MNV研究的深入，MNV感染对实验的影响越来越受到重视，一些研究表明MNV感染会对实验造成一定影响，严重的会导致结果出现偏离。Doom等报道小鼠巨细胞病毒(MCMV)模型在同时感染MNV后，虽然并不影响MCMV的感染滴度也没有引起MCMV的再活化，但会导致CD8+T细胞对MCMV的免疫优势表位的应答减弱[16]。Lencioni等发现MNV的急性感染可通过增强树突状细胞的抗原递呈活性来改变肠炎小鼠模型的疾病进程，如会加重Mdrla-/-小鼠细菌性肠炎的进程，但对Smad3-/-小鼠影响不大[17-18]。还有报道发现MNV-1的感染会加重重复感染大肠杆菌小鼠模型的炎症反应，导致其死亡率明显提高[19]。有趣的是在某些动物模型中MNV的感染会对动物起到保护作用，Thepaut等报道MNV的共感染会延长绿脓杆菌所致急性肺损伤小鼠的存活期，减少体内促炎因子的产生，但这也说明MNV的感染会显著改变传统动物感染模型的实验参数，从而导致错误的实验结果[20]。

鉴于MNV的上述特征，国际上的一些实验动物权威监管和检测机构如欧盟实验动物科学联合会(FELASA)、Charles River实验室、杰克逊实验室等均将其列为实验小鼠的常规必检项目[21]，遗憾的是我国的实验动物国家标准和其他相关标准均不包括MNV，为提高实验小鼠质量，适应我国目前实验动物科学的发展水平和应用要求，与国际标准接轨，亟需制定小鼠诺如病毒检测技术的相关标准。

2 法规依据

质检总局、国家标准委、民政部于2017年底发布的《团体标准管理规定(试行)》对团体标准的制定、实施和监督进行了详细的规定[22]，第三条对团体标准进行了定义：“团体标准是依法成立的社会团体为满足市场和创新需要，协调相关市场主体共同制定的标准”。小鼠诺如病毒检测方法团体标准的制定均严格遵照该规定的要求执行。

《团体标准管理规定(试行)》第十三条“团体标准的编写参照GB/T 1.1《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定执行”。本标准的编写也严格参照了本导则的规定进行。

本标准收集、整理了国内外有关组织、地方和实验动物专业生产公司的实验小鼠诺如病毒检测的先进标准，在研究分析质量标准和控制要求的异同点后，在我国现有的实验小鼠目前微生物质量控制研究基础之上制定。在确定本标准各项指标时，以国家科委第2号令《实验动物管理条例》和国家科委与国家技术监督局联合颁发的《实验动物质量管理办法》为依据，同时参考了国家标准《实验动物 微生物学等级及监测》、《实验动物 微生物学检测方法》，以及国际公认的具有权威性的资料如FELASA及世界动物卫生组织(OIE)等资料，使本标准的各项指标与国际水平接轨，符合国家标准的要求，使标准具有一定的可操作性。

3 内容编制

3.1 检测方法的设置

随着对MNV研究的深入，MNV的检测方法也越来越趋于成熟，目前已建立和应用的主要实验室检测技术有病毒的分离和鉴定、免疫荧光法(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)及实时荧光PCR(qPCR)等。单一的检测方法都有其优缺点，考虑到既能检测MNV抗原，又能检测病毒抗体，我们参考了欧盟实验动物科学联合会(FELASA)有关MNV的检测技术[21]，在本团体标准中规定了病毒的分离培养、IFA、ELISA、PCR及qPCR等检测方法。《团体标准管理规定(试行)》第十条规定：“团体标准的技术要求不得低于强制性标准的相关技术要求”。列入本标准的检测方法主要有两个来源，一是起草单位实验室建立并验证的方法，列入本标准的大部分方法均来自于此；另一部分是文献报道的方法，这些方法经起草单位实验室验证其敏感性、特异性及稳定性等指标，选择指标良好的方法列入本标准。没有一种检测方法是万能的，每种方法都有其优缺点及检测的局限性：病毒的分离和鉴定多用于急性病例的确诊，IFA 和ELISA主要用于检测MNV抗体，ELISA可用于大量样本的筛查，IFA可做确认试验。PCR和实时荧光PCR用于检测病毒核酸，准确快速，可在MNV抗体未出现阳转之前检测到抗原，并且适用于不产生抗体的免疫缺陷动物中MNV的检测，同时小鼠粪便作为检测样本，取样方便，不需处死动物，符合实验动物福利伦理的要求，因此目前应用较广泛。这两种方法相比，PCR方法操作简便，但实验操作较费时，并且PCR产物电泳步骤增加了交叉污染的风险；荧光PCR方法简便快捷，样品反应和结果观察均在一个体系内完成，减少了交叉污染的机会，被越来越多的广泛应用，但成本较高。在实际应用中，可根据各个实验室的检测需求和实验室的现有条件，从中选用1～2种方法应用即可。各种检测方法如果有合适的商品化试剂也可购买使用，但必须对所购买的试剂进行质控验证。

3.2 抗原检测方法

3.2.1 病毒的分离培养[23]

病毒的分离培养作为病毒感染检测的“金标准”，列入了本团体标准。MNV是第一个能在体外通过细胞进行分离培养的诺如病毒，本标准规定了MNV用RAW264.7细胞进行分离培养的技术，RAW细胞分离自白血病病毒诱发的小鼠淋巴瘤，属小鼠巨噬细胞系，易于传代培养，感染MNV后会产生明显的细胞病变，目前已被广泛用于MNV的体外培养分离。

3.2.2 核酸检测技术

(1)普通PCR方法：目前荧光PCR作为一种主流的核酸检测技术，比普通PCR方法敏感性高1至2个数量级，且PCR产物无需琼脂糖凝胶电泳，节省了实验时间，并且减少了污染的几率，有着普通PCR不能比拟的优势，但其仪器较贵，并且PCR试剂的合成费用较高，对一些还不具备荧光PCR实验条件实验室可采用成本较低的普通PCR方法。本标准所列的PCR方法包含单次PCR和套氏PCR两种方法，单次PCR相比套氏PCR，PCR进行一轮扩增，所用时间短，但单次PCR的敏感性不如套氏PCR；套氏PCR敏感性高，但需要进行两轮扩增，第2轮PCR反应是以第1轮的PCR产物为模板，因而增加了污染的几率，容易产生假阳性结果。这两种方法各有优缺点，可根据实际情况任选一种即可。

(2)荧光PCR：本标准所列的荧光PCR方法包含染料法[9]和探针法两种方法，均可用来定量检测MNV。染料法是在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光染料能特异的掺入DNA双链从而发射荧光信号，而单链DNA则不会掺入结合的特点，荧光信号的增加与PCR产物的增加成正比，通过检查荧光信号来判断是否有产物扩增。探针法主要是采用一条特异性探针，在其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。在探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；而在有特异PCR扩增时，Taq酶的酶切活性将探针酶切降解，报告基团和淬灭基团分离，淬灭作用消失，因而产生荧光信号。从原理来看，染料法不含特异探针，只有一对特异性引物，其特异性会降低，因此结果判定需要结合溶解曲线来进行，但染料法的敏感性高于探针法，最低可检测到10拷贝/μL MNV核酸。两种方法也是各有优劣，同样可根据需要选择一种方法即可。

3.3 抗体检测方法

3.3.1 ELISA

ELISA方法由于其操作简便易行的特点，是目前实验动物国家标准中检测病毒抗体的主流方法，其操作步骤参考GB/T 14926.50-2001《实验动物 酶联免疫吸附试验》。所用的检测抗原既可以是重组抗原也可以是纯化的病毒抗原，无论是重组抗原还是病毒抗原，都要求较高的纯度。

3.3.2 IFA

在ELISA检测为可疑结果的情况下(如OD值处于临界值的情况)，可用IFA进行确认实验。本标准规定了MNV接种RAW264.7细胞的免疫荧光检测方法，具体操作参照GB/T14926.52-2001 《实验动物 免疫荧光试验》。

4 未来展望

实验动物被誉为生命科学研究中的“活天平”和“活试剂”，实验动物质量关系到科学实验结果的可靠性和准确性，从而影响药品质量评价和人民群众的身体健康，因此对实验动物质量尤其是微生物和寄生虫等的预防与控制，显得尤为紧迫和需要。

我国目前对实验小鼠的微生物监测主要参照实验动物国家标准“GB 14922.2-2011 实验动物 微生物学等级及监测”，其中对清洁级小鼠病毒规定检测5项，SPF级小鼠在清洁级小鼠的基础上增加6项。国家标准的历次修订均未考虑将MNV加入，这也造成了国内大部分实验小鼠的MNV感染情况处于无监管状态，实际感染状况堪忧，对实验动物的质量及实验结果造成的潜在影响不容忽视。

《团体标准管理规定(试行)》第二十五条“团体标准实施效果良好，且符合国家标准、行业标准或地方标准制定要求的，团体标准发布机构可以申请转化为国家标准、行业标准或地方标准”。本团体标准在将来的实施和实践中也会不断的改进和提高，随着实验动物科学的发展，实验动物质量标准要求的越来越高，团体标准转化为国家标准或地方标准势在必行，将成熟的经实践检验过的团体标准转化为实验动物的国家标准，从而填补国家标准中MNV检测的空白，也是促进我们的国家标准与国际接轨，提高我国实验动物质量整体水平的必然要求。